易基因： WGBS+RNA-seq揭示松材线虫JIII阶段形成过程中的DNA甲基化差异

大家好，这里是专注表观组学十余年，领跑多组学科研服务的易基因。

松木线虫（PWN，Bursaphelenchus xylophilus）是一种破坏性病原体，可引起松树枯萎病，感染PWN的松树最终会死亡。这种微观线虫具有复杂的生命周期，具有植食性（以植物为食）和菌丝体（以真菌为食）的发育阶段，以及不同的生命周期，包括繁殖和扩散周期（图1A）。在通过载体昆虫（Monochamus spp.）传播到活树中后，PWN最初以皮层和木质部周围的上皮细胞为食，然后主要通过树脂管（植食性阶段）在树内迁移。随着树木开始出现枯萎和其他症状的迹象，PWN开始以树内存在的真菌（噬菌体）为食。在此过程中，PWN从卵孵化到三个繁殖幼体阶段（J2、J3和J4）经历一个繁殖周期，最终发育成成虫。当秋天到来时，不利的生活条件，如低温、干燥和食物短缺开始出现，引发PWN繁殖周期停止，第二阶段繁殖幼体（J2）逐渐发展为第三阶段扩散幼体（JIII）。JIII阶段能够承受不利的外部条件，在媒介昆虫的影响下，Monochamus beetles在第二年春天转化为第四阶段扩散幼体（JIV）。当Monochamus beetles出现并以健康的松树为食时，JIV阶段被转移到树上。在适当的环境条件下，JIV在松树内转化并发育成成虫，从而进入生殖周期。JIII阶段是其生命周期中的一个关键阶段，这个阶段的线虫具有感染宿主树木的能力。研究这一阶段形成过程中的DNA甲基化差异，可以帮助科学家们理解松材线虫如何调控其基因表达以适应不同的生命周期阶段，特别是与感染和致病能力相关的基因。

图1：松材线虫的生命周期和被测线虫形态。

PWN的繁殖周期和扩散周期。J2：第二阶段繁殖幼体；J3：第三阶段繁殖幼体；J4：第四阶段繁殖幼体；JIII：第三阶段扩散幼体；JIV：第四阶段扩散幼体。
本实验使用了不同发育阶段的PWN。刻度指示 100 μm。

2023年11月30日，中国林业科学研究院森林生态环境与自然保护研究所王鹏等为第一作者、理永霞研究员为通讯作者在《Curr. Issues Mol. Biol》杂志发表题为“Analysis of DNA Methylation Differences during the JIII Formation of Bursaphelenchus xylophilus”的研究论文，研究全基因组重亚硫酸盐测序（WGBS）和对应的转录组测序（RNA-seq），比较JIII阶段与其它阶段的DNA甲基化模式，揭示了DNA甲基化在PWN环境适应中的调控作用。易基因科技为本研究提供WGBS和RNA-seq建库测序分析技术服务。

研究摘要：

DNA甲基化是调控基因表达并促进生物体快速适应挑战性环境的关键过程。松材线虫（PWN；Bursaphelenchus xylophilus）是松材线虫病的病原体，通过第三阶段扩散幼体(JIII)在低温下存活，使其成为亚洲松树的主要病原体。为了了解DNA甲基化对第三阶段扩散幼体形成和环境适应的影响，研究对PWN的第三阶段扩散幼体和其他三个繁殖幼体阶段进行了全基因组亚硫酸盐测序和转录组测序。研究结果表明，样品中胞嘧啶的平均甲基化率在0.89%~0.99%之间。在PWN的第三阶段扩散幼体和第二阶段繁殖幼体中DNA甲基化发生显著变化，包括差异甲基化胞嘧啶（DMCs，n=435）和区域（DMR，n=72）。在甲基化相关转录联合分析中，23个基因在PWN第三阶段扩散幼体的形成过程中表现出差异甲基化区域和差异基因表达之间存在重叠。对这些基因的进一步功能分析表明，它们在与脂质代谢和脂肪酸合成有关的过程中富集。这些发现强调了DNA甲基化在PWN第三阶段扩散幼体发育中的重要性，因为它通过调控转录以提高PWN快速传播的可能性。

研究结果：

（1）胞嘧啶甲基化的分布和统计

图2：全基因组DNA甲基化模式。

松材线虫11个支架的全基因组甲基化图谱。（Ⓐ）mC水平。（Ⓑ）基因密度。（Ⓒ）mC密度。
四个生命阶段的平均甲基化水平。
四个生命阶段的PCA分析。

（2）DMC和DMR的鉴定和分析

图3：在松材线虫的四个不同发育阶段，DMC和DMR的全基因组分布。

在三个成对比较中，对高甲基化和低甲基化DMC的数量进行计数并分布在染色体和基因元件上：JIII与J2，JIII与J3，JIII与J4。染色体以及外显子和启动子的分布分别显示在左栏和右栏中。
计算高甲基化和低甲基化DMR的数量，并将其分布在染色体和基因元件上。

（3）JIII形成过程中DMR的GO分析

图4：DMR中DMG的GO富集结果。

相对于对照组（松材线虫JIII与J2），实验组中由高甲基化DMR修饰的基因的功能富集分析。
JIII与J2中低甲基化DMR修饰的基因的富集。y轴表示通路名称，x轴表示富集因子，气泡大小表示每个通路中的基因数量。该图仅显示具有统计学意义的条目（rawP<0.05）。如果每种类型有超过10条显著富集通路，则仅显示每种类型的前10条通路结果。GO分为三个本体，即：分子功能（MF），细胞成分（CC）和生物过程（BP）。

（4）转录组分析和通路富集总结

图5：松材线虫JIII形成过程中的RNA-seq测序分析。

JIII与J2中差异表达基因（DEG）的火山图。红点和绿点表示显著上调和下调的差异基因，黑点表示不显著差异基因。
JIII与J2中DEG的热图。红色表示上调的基因，紫色表示下调的基因。
JIII与J2中DEG的GO富集。GO分为三个本体，即：分子功能（MF），细胞成分（CC）和生物过程（BP）。
JIII与J2中DEG的KEGG通路富集。点的大小代表富集到条目的基因总数，较小的p.adjust值由更红色表示。

（5）JIII形成过程中DMRs与基因表达的相关性分析

图6：松材线虫JIII与J2中低甲基化和转录变化基因的GO富集分析。

GO富集基因体中的甲基化基因，而转录减少。
GO富集基因体中甲基化基因，同时转录升高。
GO富集启动子中甲基化基因，而转录减少。
GO富集启动子中甲基化基因，同时转录升高。

（6）DNA甲基化和转录组的验证

图7：使用RT-qPCR验证RNA-seq和DNA甲基化。

选定DNA片段的DNA甲基化验证。
RNA-Seq结果中的RT-qPCR验证。

研究小结

本研究首次在松材线虫（PWN）全基因组范围内绘制了DNA甲基化水平的分布情况，证实了线虫在四个发育阶段中均存在DNA甲基化。在扩散性JIII阶段与繁殖性阶段之间，甲基化存在显著差异，表明DNA甲基化可能在JIII阶段抗不利环境条件中发挥潜在作用。研究还支持DNA甲基化在JIII形成过程中相关基因调控中的参与。在低甲基化区域高表达的基因可能通过调节脂质代谢通路，促进JIII阶段的形成和环境适应性。此外在JIII形成过程中，Enr和Pex10基因甲基化水平下调可以促进这些基因表达。又增强JIII在脂肪酸合成和脂质平衡维持中的参与度，使其能够在不利环境中生存。本研究为理解PWN快速扩张的机制提供了新的见解，并为松材线虫枯萎病的预防和控制奠定了理论基础。然而，需要进一步研究来阐明DNA甲基化的调控机制。

关于易基因全基因组重亚硫酸盐测序（WGBS）

全基因组重亚硫酸盐甲基化测序（WGBS）可以在全基因组范围内精确的检测所有单个胞嘧啶碱基（C碱基）的甲基化水平，是DNA甲基化研究的金标准。WGBS能为基因组DNA甲基化时空特异性修饰的研究提供重要技术支持，能广泛应用在个体发育、衰老和疾病等生命过程的机制研究中，也是各物种甲基化图谱研究的首选方法。

易基因全基因组甲基化测序技术通过T4-DNA连接酶，在超声波打断基因组DNA片段的两端连接接头序列，连接产物通过重亚硫酸盐处理将未甲基化修饰的胞嘧啶C转变为尿嘧啶U，进而通过接头序列介导的 PCR 技术将尿嘧啶U转变为胸腺嘧啶T。

应用方向：

WGBS广泛用于各种物种，要求全基因组扫描（不错过关键位点）

全基因组甲基化图谱课题
标志物筛选课题
小规模研究课题

技术优势：

应用范围广：适用于所有参考基因组已知物种的甲基化研究；
全基因组覆盖：最大限度地获取完整的全基因组甲基化信息，精确绘制甲基化图谱；
单碱基分辨率：可精确分析每一个C碱基的甲基化状态。

易基因科技提供全面的表观遗传学研究（DNA甲基化、RNA甲基化、染色质结构与功能组学）及多组学研究整体解决方案，详询易基因：0755-28317900。

参考文献：Wang P, Li Y, Liu Z, Zhang W, Li D, Wang X, Wen X, Feng Y, Zhang X. Analysis of DNA Methylation Differences during the JIII Formation of Bursaphelenchus xylophilus. Curr Issues Mol Biol. 2023 Nov 30;45(12):9656-9673. pii: cimb45120603. doi: 10.3390/cimb45120603. PubMed PMID: 38132449.