出生体重较低的宫内生长受限（Intrauterine growth restriction，IUGR）影响肠道的生长、形态和功能，导致生长性能不佳和高死亡率。最近研究表明，IUGR导致肠道中不同的DNA甲基化，可能在IUGR肠道损伤中起关键作用。母体营养可以通过表观遗传修饰（例如DNA甲基化和组蛋白乙酰化）导致后代的永久表型变化。妊娠期膳食补充甲基供体（methyl donor，MET）可提高后代的出生体重和出生后生长速度。然而在IUGR猪模型中，母体补充MET对胃肠道发育的影响及其潜在机制尚不清楚。
2024年2月4日，四川农业大学动物营养研究所车炼强教授团队在《Journal of Animal Science and Biotechnology》 杂志发表题为“Effects of maternal methyl donor intake during pregnancy on ileum methylation and function in an intrauterine growth restriction pig model”的研究论文，探讨了在猪IUGR模型中，补充母体膳食甲基供体（MET）是否通过改善肠道生长、功能和回肠的DNA甲基化来缓解IUGR并增强后代的生长性能。
标题：Effects of maternal methyl donor intake during pregnancy on ileum methylation and function in an intrauterine growth restriction pig model（妊娠期母体甲基供体摄入对宫内生长受限猪模型回肠甲基化及功能的影响）
时间：2024-2-4
期刊：J Anim Sci Biotechnol
影响因子：IF 7
技术平台： RRBS等
研究摘要：
从配种到分娩，研究将40头多产母猪分配到对照组或MET饮食组。分娩后，从8窝仔猪中选择8对IUGR和正常出生体重（normal birth weight，NBW)的仔猪进行初乳前取样。结果表明，母体补充MET有降低IUGR发生率和增加仔猪平均断奶体重的趋势。此外，母体MET补充显著降低了母猪和新生仔猪中血浆中异亮氨酸、半胱氨酸、尿素和总氨基酸浓度。此外还增加了新生仔猪空肠中的乳糖酶和蔗糖酶活性。MET添加导致新生仔猪回肠中甲硫氨酸合酶活性降低，同时增加回肠中甜菜碱同型半胱氨酸S-甲基转移酶活性。回肠的DNA甲基化分析（IUGR/NBW对中选择16个回肠样本RRBS (每组1-8个)）表明，补充MET可提高新生仔猪回肠DNA CpG位点的甲基化水平。下调的差异甲基化基因在叶酸结合、胰岛素受体信号通路和内皮细胞增殖中富集。而上调的甲基化基因在生长激素受体信号通路和一氧化氮生物合成过程中富集。
总之，本研究表明母体补充MET可以降低IUGR发生率，增加仔猪断奶窝重，可能与更好的肠道功能和甲基化状态有关。
实验结果：
（1）与基因组特征相关的全基因组 CpG 甲基化
与CON_IUGR组和CON_NBW组相比，MET_NBW组的DNA甲基化显著增加。尽管与MET/IUGR相比，MET/NBW的DNA甲基化增加了2.4%，但不同出生体重的仔猪没有明显的甲基化改变。
表1：母体膳食补充MET对新生仔猪回肠DNA甲基化水平的影响
CpG甲基化模式分析（图1A）显示，与CON_NBW组相比，CON_IUGR组仔猪的回肠呈现低甲基化水平。然而在MET_IUGR和CON_IUGR组中，MET补充后回肠的CpG甲基化水平显著增加（图1B）。所有组中在CpG岛观察到CpG甲基化水平低于CpG岛岸（图1C）。此外，所有样本在启动子区域中心显示出甲基化的类似下降趋势（图1D），这种趋势逐渐向genebody区域增加（图1D）。
图1：与基因组特征以及IUGR和MET诱导的DMC相关的全基因组CpG位点甲基化。
A-B. 不同基因组特征的平均CpG甲基化水平。数据表示为平均值±SEM
C-D. 与基因区域和元件模式相关的CpG甲基化水平
（2）胞嘧啶甲基化的基因组分布
在本研究中，与上游2kb、下游2kb或genebody区域的甲基化peak重叠基因称为甲基化基因。其中，1659个甲基化基因在CON_IUGR组和CON_NBW组中被鉴定为差异表达基因。CON_IUGR组中包括1044个高甲基化基因和1245个低甲基化基因。在MET_IUGR组和MET_NBW组中，共有1887个甲基化基因被鉴定为差异表达基因，其中包括CON_IUGR组中的1233个高甲基化基因和1406个低甲基化基因。差异甲基化位点位于genebody中，小部分位于外显子和启动子中。
表2：不同组不同基因区的差异甲基化基因数量
（3）BW和MET诱导的DMR甲基化谱变化
接下来分别在CON_IUGR组 vs CON_NBW组和MET_IUGR组 vs MET_NBW组之间鉴定出差异甲基化CpG（DMCs）。DMCs基于<0.05的Q值和两组之间的甲基化差异>10%标准。在评估CON_IUGR和CON_NBW仔猪回肠时，共鉴定出 80265个DMC，包括 33000个高甲基化DMC和47265个低甲基化 DMC。随后在分析MET_IUGR仔猪回肠和MET_NBW仔猪回肠时鉴定了100249个DMC，包括45221 个高甲基化DMC和55028个低甲基化DMC。最后，在MET_IUGR仔猪与CON_IUGR仔猪的比较中鉴定出87919个DMC，包括47883个高甲基化DMC和40036个低甲基化DMC。前1000个差异甲基化位点热图显示，该位点子集可以非常容易区分 BW 组和 MET 补充组（图2）。
图2：仔猪回肠前1000个差异甲基化位点热图。
此热图中的每行对应于单个位点，而每列对应于单个样本。ACON_IUGR和CON_NBW（A），BMET_IUGR和MET_NBW（B），CMET_IUGR和CON_IUGR（C）。热图旁边的分支树状图（dendrogram）对应于样本之间的关系，通过使用这1000个位点进行聚类来确定。所有图表显示相似数量位点的相对高甲基化和低甲基化（红色到蓝色）。这种可视化方法有助于鉴定和比较不同样本之间的甲基化模式，从而揭示可能与特定表型或处理（如MET补充）相关的基因调控区域。
（4）BW和MET诱导的回肠DNA甲基化变化
研究结果显示，IUGR（宫内生长受限）组和NBW（正常出生体重）组新生仔猪的回肠DNA甲基化存在显著差异（图3A）。主成分分析表明，与喂食对照饮食和甲基供体饮食的两组母猪相比，IUGR仔猪的回肠DNA甲基化存在显著差异（图3B）。在甲基供体组的IUGR仔猪与CON组的NBW仔猪之间，回肠组织DNA甲基化水平的差异较小。
表明IUGR状态可能会影响新生仔猪回肠的DNA甲基化模式，而母体饮食中甲基供体补充可能有助于减少IUGR仔猪与正常体重仔猪之间的甲基化差异。这种甲基化模式的变化可能与肠道功能和发育有关，进而影响仔猪的生长表现和健康状况。
图3：体重和MET补充诱导的差异甲基化CpG位点（DMCs）。
- 不同组仔猪中DMC数量Venn图。显示了与不同对之间重叠的DMCs进行基因交叉匹配的结果。
- 主成分分析（PCA）显示不同组的DNA甲基化差异。
（5）BW和MET诱导的染色体差异甲基化
不同组的差异甲基化在覆盖所有染色体的Circos图中表示。Circos图表示组间差异甲基化区域（图4A和B）。最外圈（不同颜色显示）代表不同的染色体，特定染色体名称在图上标记。第二个圆圈（黑色和白色圈）代表基因密度。第三圈（蓝色圈）代表处理组的甲基化水平。第四圈表示差异甲基化水平，最内圈表示CON组甲基化水平。在比较CON_IUGR组和CON_NBW组时，DMC位于1-3、6和12号染色体上（图4A和C）。6号染色体的二甲基化水平最高，包括3177个高甲基化和5097个低甲基化DMC。比较MET_IUGR组和MET_NBW组时，DMC位于X染色体上，有5864个高甲基化和3434个低甲基化DMC（图4B和D），结果表明补充MET后回肠甲基化水平增加。
图4：仔猪回肠DMC甲基化谱Circos图。
A和C. CON_IUGR组与CON_NBW组的比较。
B和D. MET_IUGR组与MET_NBW组的比较。
蓝色代表不同组DMCs的甲基化水平。粉色代表不同组DMC的差异甲基化水平。
（6）DNA甲基化的GO富集分析
基因甲基化状态比较分析结果表明，CON_IUGR组和CON_NBW组之间存在显著差异的甲基化模式。大多数DMRs位于基因上下游±2kb区域。许多基因在IUGR低甲基化中富集，如转录调控、发育过程和细胞表面基因（图5B）。部分基因在IUGR中显著下调，甲基化基因倾向于转录因子活性和叶酸结合中富集。在生物学过程中，基因在与激素反应、细胞粘附、胰岛素受体信号通路、内皮细胞增殖和脂肪细胞分化相关功能中富集（图5A）。对这些基因的进一步研究可以阐明IUGR仔猪回肠中低甲基化功能。
与MET_NBW组相比，MET_IUGR组的基因甲基化状态降低，低甲基化基因在分子功能类别中倾向于在钙铁结合中富集，在细胞成分类别中倾向于在细胞表面基因中富集（图5B）。基因甲基化状态比较分析表明，MET_IUGR组和CON_IUGR组之间存在差异甲基化模式。上调的甲基化基因倾向于生长激素受体信号通路通过JAK-STAT信号通路、ER相关错误折叠蛋白、转化生长因子β激活受体活性和一氧化氮（NO）生物合成过程中富集。显著富集的下调基因包括胰岛素样生长因子I结合、脂肪酸β-氧化、钙调蛋白依赖性蛋白激酶活性、钙离子结合和DNA结合转录因子活性（图5C)。
图5：仔猪回肠中由DNA甲基化驱动的代表性基因GO富集分析。
- CON_IUGR组与CON_NBW组比较；
- MET_IUGR组与MET_NBW组比较；
- MET_IUGR组与CON_IUGR组比较。
研究小结：
IUGR可导致猪模型中肠道DNA甲基化异常。通过调控相关基因表达及其在各种生物过程中的功能，例如NO生物合成过程，通过JAK-STAT激素受体通路和多巴胺受体信号通路，可以通过母体MET补充来缓解DNA甲基化变化。这些发现可能为养猪业和人类患者IUGR改善提供方向。
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参考文献：
Lin Y, Wu J, Zhuo Y, Feng B, Fang Z, Xu S, Li J, Zhao H, Wu D, Hua L, Che L. Effects of maternal methyl donor intake during pregnancy on ileum methylation and function in an intrauterine growth restriction pig model. J Anim Sci Biotechnol. 2024 Feb 4;15(1):19. pii: 10.1186/s40104-023-00970-w. doi: 10.1186/s40104-023-00970-w. PubMed PMID: 38310243.
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