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mRNA中的N6-甲基腺苷（m6A）和DNA中的5-甲基胞嘧啶（5mC）对于调控基因表达和调节植物生长发育具有关键功能。然而，m6A和5mC之间的互作是一个难以捉摸的领域，在植物中的机制尚不清楚。
2023年11月23日，中国农业大学贺岩教授课题组以“RNA m6A modification facilitates DNA methylation during maize kernel development“为题在《Plant Physiol》杂志发表研究论文，研究揭示了玉米（Zea mays）籽粒发育过程中m6A和5mC之间的密切关系，至少部分归因于ZmMTA（Zea mays MTA，m6A关键参与因子）和ZmDDM1（5mC关键参与分子）之间的相互作用，且RNA修饰和DNA甲基化之间的互作可能在植物中保守。
标题：RNA m6A modification facilitates DNA methylation during maize kernel development（RNA m6A修饰促进玉米籽粒发育过程中的DNA甲基化）
时间：2023-11-28
期刊：Plant Physiology
影响因子：IF 7.4/ 1区
技术平台：MeRIP-seq（m6A-seq）、BS-seq、RNA-seq等
研究摘要：
本研究通过m6A-seq和BS-seq等分析揭示了玉米（Zea mays）中m6A和5mC之间通过mRNA腺苷甲基化酶（ZmMTA）（m6A甲基转移酶复合体的关键因子）与DNA甲基化1（ZmDDM1）（调控DNA甲基化的关键染色质重塑因子）减少之间的相互作用而发生串扰。与无m6A修饰的基因相比，带有m6A修饰的基因具有更高水平的DNA甲基化。ZmMTA功能丧失导致玉米胚胎发生和胚乳发育过程中严重停滞，导致m6A修饰基因5'区CHH甲基化显著降低。而ZmDDM1功能丧失对ZmMTA相关活性没有明显影响。这项研究在玉米籽粒发育过程中建立了m6A和5mC之间的直接联系，并提供了RNA修饰和DNA甲基化之间相互作用的见解。
研究结果
（1）RNA m6A修饰与DNA甲基化之间的相互作用
图1：m6A修饰和DNA甲基化的协作。
- 在genebody及其±2 kb区域中，比较每个序列背景（CG，CHG和CHH）的所有基因（带有或不带有m6A修饰）的DNA甲基化水平。m6A修饰基因是指具有m6A peaks的基因，m6A沉默基因是指没有m6A peaks的基因。总基因n=20316，带有m6A修饰基因n=7472，不带有m6A修饰基因n=12844。使用双侧Wilcoxon符号秩检验进行统计分析：*P<0.05，**P<0.01和***P<0.001。
- 不同m6A强度的基因的DNA甲基化谱。所有m6A修饰基因根据m6A强度从高到低分为3组，分别用红色、蓝色和黑色表示。将具有高水平和中等水平m6A修饰基因分别与具有中等水平和低水平m6A修饰的基因进行比较。每组基因n=2490。统计学分析采用双侧Wilcoxon符号秩检验：*P<0.05，**P<0.01，**P<0.001。
（2）ZmMTA在玉米胚乳发生和胚乳发育中的作用
图2：ZmMTA功能丧失严重阻碍了玉米的胚胎发生和胚乳发育。
- ZmMTA基因结构图和EMS突变位点。黑色框和白色框分别表示外显子和UTR。红色框表示MT-A70域的编码区。EMS突变位点用三角形标记。
- zmmta-1/+在14 DAP（左）和成熟期（右）的自交穗。代表性的突变核用红色箭头表示。对图像进行数字提取以进行比较。Bar=1 cm。
- 4~14 DAP野生型和zmmta-1突变体核的石蜡切片。这些切片用碱性品红染色。Bars=1 mm。
- 突变位点的野生型和zmmta-1突变体进行Sanger测序。
- Western blot检测野生型和ZmMTA-1突变体核中ZmMTA蛋白的表达。
- 野生型和zmmta-1突变体在14 DAP时的流式细胞术图谱。C值显示在每个peak顶部。
- LC-MS/MS分析显示野生型和zmmta-1突变体的总mRNA m6A丰度。数据代表3个生物学重复的平均值±SD。统计分析采用t检验。
（3）zmmta功能丧失影响大量基因的表达和胚胎发育
图3：野生型和zmmta-1突变体中转录组比较分析。
A~B. 相对于野生型，zmmta-1突变体中的DEGs（A）或TEs（B）。DEGs（或TEs）（倍数变化≥2，FDR<0.01）用红色或蓝色表示，而未变化的基因（或TEs）用灰色表示。
C. zmmta-1胚胎中下调（上）或上调（下）DEG的GO富集分析。圆圈的大小表示DEG的数量。颜色表示每个GO项的-log 10（P值）。
（4）ZmMTA对于m6A修饰基因的5'区域的mCHH是必需的
图4：ZmMTA促进m6A修饰基因5'区的mCHH。
A） 野生型和zmmta-1突变体中的整体DNA甲基化水平。使用Fisher精确检验对野生型和zmmta-1突变体进行统计分析，共有3个生物学重复：*P<0.05和**P<0.01。
B） 野生型和zmmta-1突变体中带有或不带有m6A修饰的基因中DNA甲基化（CG，CHG和CHH）的宏基因谱。野生型和zmmta-1突变体中m6A+的n=7472，m6A-的n=12844。使用野生型和zmmta-1突变体之间的双侧Wilcoxon符号秩和检验进行统计分析：*P＜0.05，**P＜0.01和***P＜0.001。
（5）ZmMTA与ZmDDM1的相互作用
图5：ZmMTA与ZmDDM1相互作用。
A） ZmMTA和ZmDDM1的Co-IP（共免疫沉淀）实验。野生型ZmDDM1 的IP产物中检测到ZmMTA，但未从ZmDDM1突变体中检测到。同样，在野生型的ZmMTA-IP产物中检测到ZmDDM1，但未从ZmMTA-1突变体中检测到。
B） Y2H（酵母双杂交）实验显示ZmMTA与ZmDDM1A或ZmDDM1 B的相互作用。AD表示GAL4激活域；BD表示GAL4 DNA结合结构域。使用空的pGADT7和pGBKT7载体之间的相互作用作为阴性对照。
C） LCI（荧光共振能量转移）实验显示N.benthamiana叶片中ZmMTA与ZmDDM1A或ZmDDM1B的相互作用。左上部分显示互作信号；其他3个部分显示阴性对照信号。每个部分旁边的标签表示特定的组合。荧光信号强度表示相互作用活性。
（6）RNA m6A修饰促进ZmDDM1靶向TSS
图6：m6A促进ZmDDM1与TSS（转录起始位点）的结合。
- 饼图描绘了ZmDDM1A和ZmDDM1 B在带有或不带有m6A修饰基因的5个片段的peaks分布。ZmDDM1-occupied基因是指具有ZmDDM1 peaks基因，而ZmDDM1-unoccupied基因指没有ZmDDM2 peaks的基因。
- 野生型ZmDDM1占比Metaplots图。基于m6A修饰和ZmDDM1A（左）和ZmDDM1B（右）占比情况将所有表达的基因分为4类。在有或没有ZmDDM1A基因之间进行比较。使用双侧Wilcoxon符号秩检验进行统计分析：*P<0.05、**P<0.01和***P<0.001。
- 野生型基因mCHH的Metagene图谱。所有表达基因根据m6A修饰和ZmDDM1A（左）和ZmDDM1B（右）被分为4类。在有或没有ZmDDM1B基因之间进行比较。使用双侧Wilcoxon符号秩检验进行统计分析：*P<0.05、**P<0.01和***P<0.001。
（7）ZmDDM1变化对ZmMTA相关活性没有影响
图7：ZmDDM1对ZmMTA相关活性没有影响。
- 野生型和zmddm1突变体中ZmMTA转录本丰度的RT-qPCR分析。数据代表3个生物学重复的平均值±SD。使用Student t检验进行统计分析。
- 野生型和zmddm1突变体中ZmMTA蛋白丰度的Western blot分析。
- 野生型和zmddm1突变体中的ZmMTA蛋白免疫定位分析。Bars=5μm。
- LC-MS/MS分析显示野生型和zmddm1突变体中的整体mRNA m6A丰度。数据代表三个生物学重复的平均值±SD。使用Student t检验进行统计分析。
- 野生型和zmddm1突变体中m6A位点沿标准化转录本分布的Metagene图谱。
- 饼图描绘野生型（左）和zmddm1突变体（右）中非重叠转录本片段中的m6A peaks分布。
研究小结
本研究通过MeRIP-seq和BS-seq的综合分析揭示了m6A和5mC之间的全基因组关联，并表明了RNA m6A甲基转移酶ZmMTA与染色质重塑因子ZmDDM1相互作用，并可能促进其靶向TSS。本研究揭示了m6A和5mC之间的相互作用，并表明RNA修饰信息从RNA直接传递至DNA，以调控复杂的表观基因组。考虑到m6A和5mC在介导基因表达中的广泛作用，这种动态变化可能在许多细胞环境中具有重要的调控功能。
关于易基因RNA m6A甲基化测序(MeRIP-seq)技术
易基因MeRIP-seq技术利用m6A特异性抗体富集发生m6A修饰的RNA片段（包括mRNA、lncRNA等rRNA去除所有RNA），结合高通量测序，可以对RNA上的m6A修饰进行定位与定量，总RNA起始量可降低至10μg，最低仅需1μg总RNA。广泛应用于组织发育、干细胞自我更新和分化、热休克或DNA损伤应答、癌症发生与发展、药物应答等研究领域；可应用于动物、植物、细胞及组织的m6A检测。
大样本量m6A-QTL性状关联分析，传统MeRIP单个样品价格高，通常难以承担。易基因开发建立MeRIP-seq2技术，显著提成IP平行性，实现不同样本间相对定量，降低检测成本。
易基因提供适用于不同科研需求的MeRIP技术：
- m6A甲基化-常量mRNA 甲基化测序（MeRIP-seq）
- m6A甲基化-常量mRNA +lncRNA甲基化测序（lnc-MeRIP-seq）
- m6A甲基化-微量mRNA +lncRNA甲基化测序（Micro-lnc-MeRIP-seq）
- 高通量m6A甲基化-常量mRNA甲基化测序（MeRIP-seq2）
技术优势：
- 起始量低：样本起始量可降低至10-20μg，最低仅需1μg总RNA；
- 转录组范围内：可以同时检测mRNA和lncRNA；
- 样本要求：可用于动物、植物、细胞及组织的m6A检测；
- 重复性高：IP富集重复性高，最大化降低抗体富集偏差；
- 应用范围广：广泛应用于组织发育、干细胞自我更新和分化、热休克或DNA损伤应答、癌症的发生与发展、药物应答等研究领域。
研究方向：
m6A甲基化目前主要运用在分子机制的理论性研究
- 疾病发生发展：肿瘤、代谢疾病（如肥胖/糖尿病）、神经和精神疾病（如阿尔兹海默症/抑郁症）、炎症…
- 发育和分化：早期胚胎发育、个体/组织/器官生长发育、干细胞分化与命运决定、衰老
- 环境暴露与响应：污染、抗逆、生活方式
关于m6A甲基化研究思路
（1）整体把握m6A甲基化图谱特征：m6A peak数量变化、m6A修饰基因数量变化、单个基因m6A peak数量分析、m6A peak在基因元件上的分布、m6A peak的motif分析、m6A peak修饰基因的功能分析
（2）筛选具体差异m6A peak和基因：差异m6A peak鉴定、非时序数据的分析策略、时序数据的分析策略、差异m6A修饰基因的功能分析、差异m6A修饰基因的PPI分析、候选基因的m6A修饰可视化展示
（3）m6A甲基化组学&转录组学关联分析：Meta genes整体关联、DMG-DEG对应关联、m6A修饰目标基因的筛选策略
（4）进一步验证或后期试验
关于易基因全基因组重亚硫酸盐测序（WGBS）
全基因组重亚硫酸盐甲基化测序（WGBS）可以在全基因组范围内精确的检测所有单个胞嘧啶碱基（C碱基）的甲基化水平，是DNA甲基化研究的金标准。WGBS能为基因组DNA甲基化时空特异性修饰的研究提供重要技术支持，能广泛应用在个体发育、衰老和疾病等生命过程的机制研究中，也是各物种甲基化图谱研究的首选方法。
易基因全基因组甲基化测序技术通过T4-DNA连接酶，在超声波打断基因组DNA片段的两端连接接头序列，连接产物通过重亚硫酸盐处理将未甲基化修饰的胞嘧啶C转变为尿嘧啶U，进而通过接头序列介导的 PCR 技术将尿嘧啶U转变为胸腺嘧啶T。
应用方向：
WGBS广泛用于各种物种，要求全基因组扫描（不错过关键位点）
- 全基因组甲基化图谱课题
- 标志物筛选课题
- 小规模研究课题
技术优势：
- 应用范围广：适用于所有参考基因组已知物种的甲基化研究；
- 全基因组覆盖：最大限度地获取完整的全基因组甲基化信息，精确绘制甲基化图谱；
- 单碱基分辨率：可精确分析每一个C碱基的甲基化状态。
易基因提供全面的表观基因组和表观转录组研究解决方案，详询易基因：0755-28317900.
参考文献：
Luo JH, Guo T, Wang M, Liu JH, Zheng LM, He Y. RNA m6A modification facilitates DNA methylation during maize kernel development. Plant Physiol. 2023 Nov 23. pii: 7444906. doi: 10.1093/plphys/kiad625. PubMed PMID: 37995374.
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标签：DNA,甲基化,互作,ZmMTA,RNA,基因,m6A,修饰 From： https://www.cnblogs.com/E-GENE/p/17998700