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生信领域大神李恒今年发在预印本上的一篇综述：Genome assembly in the telomere-to-telomere era，小编总结下要点。
影响组装的基因组特性
决定基因组组装难易程度的主要因素不是基因组大小，而是它的重复结构。重复序列可以通过比其更长的reads来解析。但是，还有更长的重复区域。例如，人类 1 号染色体的着丝粒周围区域含有 20 Mb 的重复序列比当前测序技术产生的读长要长得多。但我们仍然可以通过准确的长读长来组装这个区域。尽管它和其他此类区域由相似的重复拷贝组成，但它们随着时间的推移积累了突变，并且很少在10 kb以上共享相同的重复序列。给定长的无错误读长，我们可以区分不同的重复拷贝并成功组装它们。Reads从来都不是完全没有错误的，但是当reads错误率足够低并且测序错误足够独立时，我们可以纠正大多数错误并实现高质量的组装。
重复序列大致可分为三类：间隔重复序列（interspersed repeats）、串联重复序列（tandem repeats）和片段重复序列（segmental duplications）。
- 间隔重复序列大多是分散在基因组中的转座元件。它们几乎都比现代长读长读短，因此不再对组装构成重大挑战。
- 染色体臂上的大多数串联重复序列比长读长序列短，因此也易于组装。然而，卫星重复序列（satellite repeats）是一种通常富含着丝粒的超长串联重复序列，特别难以组装，因为整个卫星阵列不能被长读长跨越。
- 片段重复是指基因组中重复的非常长的DNA片段，通常比长reads甚至超长reads要长。它们中的许多是聚集在一起的，可以串联。虽然古老的固定区段重复很容易解决，因为它们自其共同祖先以来通过突变积累了差异，但长多态性重复具有挑战性。
- 核糖体 DNA （rDNA） 可以组织为由高度相似的拷贝组成的长串联阵列。长 rDNA 阵列是最难组装的区域之一。
长读长和长范围（long-range）测序技术
长读长技术可生成长度通常为 ≥10 kb 的连续读序列。
2019 年，PacBio 推出了长度为 10–20 kb 且错误率低于 0.5% 的高保真 （HiFi） 读长。这些有效地取代了 PacBio 错误率为 >10% 的旧连续长读长 （CLR）。
目前面向大众市场的 ONT 产品的准确率大致在 90-95% 左右，长度为 ≥100 kb。最新的 ONT v14 化学反应可以使用最新的 Dorado 碱基调用器生成准确率为 98-99% 的读数。ONT正在积极开发双链测序技术，该技术可对DNA片段的两条链进行测序，在准确性上接近 PacBio HiFi，并且可以更长。
即使是超长读长，也很少跨越超过几百Kb。为了可靠地获得染色体长支架和相位，需要长范围数据，使用最广泛的是Hi-C。Pore-C 与 Hi-C 类似，但使用 ONT 测序。Strand-seq 是另一种特别擅长染色体分组和重叠群定向的技术，但更昂贵，并且无法在市场上买到。亲本序列数据或三重数据（trio data）对于全基因组定相非常强大，也可以被视为一种长范围数据。
近T2T基因组组装
对于纯合基因组，近T2T组装的最可靠解决方案同时使用 PacBio HiFi reads 和 ONT 超长读长。一般先用 HiFi reads 来构建一个初始组装图，再用超长填补间隙。
组装杂合二倍体基因组遵循类似的策略。对于具有长纯合区域的基因组，单独使用HiFi和超长的组合可能无法使整个染色体分相。在这种情况下，建议使用三重数据来提供整个基因组的准确分相。当无法获得亲本样本时，可能使用Hi-C代替。Hi-C 仅提供重叠群之间的相对相位信息，不如三重数据强大，尤其是在纠结的子图中，但Hi-C仍然是可靠支架染色体的关键数据类型。将 HiFi 与 trio、Hi-C 或 Strand-seq 等长范围数据相结合，可以产生一对单倍型分辨组装，此组装具有相当的连续性。它还保留了相位，并且可以进一步用 Hi-C 搭建成分相染色体。
核心组装算法
现代长读长组装基本都是基于图论，即overlap graph或de Bruijn graph。在此图中，顶点表示一个序列，一条边表示从读取中推断出的可能连接。理想情况下，组装图将所有信息保留在读取中，没有冗余。然而，由于重复和倍性，它通常是非线性的。
评估序列组装
基本指标
组装大小、contig长度综合、N50等。对于二倍体常染色体组装要有一对分相组装且具有相似大小，一对不平衡的常染色体组装可能表明分相不完整，可能要手动参数调整。性染色体很可能具有不同的大小。物种内的其他倍性变异也可能发生，例如由于体细胞染色体丢失或减少。
评估基因完整性
BUSCO是首选。minimap2 软件包中的“asmgene”工具是 BUSCO 的替代方案，还可以解决存在高质量参考基因组时的低完整性问题。
基于 K-mer 的评估
假设 k-mer 的计数与其读长计数成正比， k-mer 在读长中具有高频率但组装中不存在，表明序列缺失。KAT 是一个强大的工具，它利用这些简单的观察结果来评估组装。
使用k-mers来估计重叠群序列的基本准确度是一种常见的做法，通常以Phred scake作为QV（Quality Value）进行测量。目前有两种实现，Merqury 和 yak 。
基于比对的评估
理想情况下，当我们将序列读长与其组装比对时，我们期望在每个重叠群位置都能均匀覆盖。在较长的区域上覆盖率过低或过高都表明存在潜在的组装错误。我们还希望重叠群能够得到基础级别的读取的良好支持。Flagger、Asset和 Inspector是基于读长到程序集比对的面向用户的评估工具。
对于具有近乎完美的基因组，可以此作为基本事实，以评估使用较少数据类型或较低读取覆盖率生成的自动化程序集。QUAST 是很好的工具，这种基于比对的方法对于开发人员调整组装算法非常宝贵，但不适用于新物种，或者当“真实”组装和评估组装来自不同的菌株或不同样品时。
李恒的观点
在讨论部分，李恒指出了overlap-based和DBG两种算法组装、HiC数据以及组装软件的不足，他很看好ONT最新的simplex reads，兼顾超长与准确性，可能会大大简化高质量基因组组装。
我们能否用当前数据自动组装从端粒到端粒的所有染色体？李恒认为是不行的。他认为，过去几年的大部分进步都是由于数据质量的提高而取得的，而当前的软件从可用的输入数据中提取了大部分信息。仅靠算法改进可能无法可靠地解决所有组装gap。
我们期待在测序技术方面不断取得新的进展，以便在没有人为干预的情况下真正完成基因组。需要注意的是，一个完整的组装只是为下游生物学发现设定了一个开始。虽然基因组组装进展迅速，但基因组比对和注释工具却远远落后。我们希望在未来看到这些工具的持续发展，以实现（近乎）完整组装的全部功能。
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