易基因：通过cfDNA甲基化和半甲基化分析结合机器学习检测多癌种生物标志物

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癌症是全球主要的公共卫生威胁，虽然癌症死亡率自 1991 年达到顶峰以来持续下降，但仅在 2021 年，美国就有超过 60万人死于癌症。2020年，全球有近1000万人死于癌症，近年来一些低收入和中等收入国家的死亡率有所上升。因此，抗击癌症的需求仍然紧迫且未得到满足。研究表明，早期肿瘤检测对于改善癌症患者的预后至关重要。例如，肝细胞癌 （HCC） 的早期诊断时的五年生存率为 34%，但晚期诊断（远端转移）时，其生存率则降至3%。因此，开发用于早期癌症检测的检测方法至关重要。血浆中的细胞游离细胞DNA（cell-free DNA，cfDNA）是肿瘤检测的潜在生物标志物，但其中存在于约10%CpG二核苷酸中的半甲基化（hemi-methylation）模式尚未得到充分研究。

2024年7月20日，美国哥伦比亚大学Zhiguo Zhang（张志国）教授团队在Nature子刊《Nature Communications》杂志发表题为“Tumor detection by analysis of both symmetric- and hemi-methylation of plasma cell-free DNA”的研究论文，研究通过cfMeDIP-seq结合机器学习方法分析了肝脏肿瘤和血浆游离DNA（cfDNA）中的差异半甲基化区域（DHMRs），揭示了大多数DHMRs与相同样本中的差异甲基化区域（DMRs）不重叠，表明DHMRs可以作为独立的生物标志物。同时，通过分析患有肝癌或脑癌的个体样本以及无癌症个体样本（对照组）共计215例样本的cfDNA甲基化组，并利用DMRs、DHMRs或DMRs+DHMRs两者训练机器学习模型。结合DMRs+DHMRs的模型，比只使用DMRs或DHMRs训练的模型表现出更优越的性能，在验证队列中，区分对照组、肝癌和脑癌的AUROC值分别为0.978、0.990和0.983。这项研究支持了同时利用DMRs和DHMRs进行多癌种检测的潜力。

标题：Tumor detection by analysis of both symmetric- and hemi-methylation of plasma cell-free DNA（通过分析血浆cfDNA的对称甲基化和半甲基化来检测肿瘤）

期刊：Nature Communications

影响因子：IF 14.7 / 1区

技术平台：cfMeDIP-seq等

研究思路：

• 利用改进版甲基化DNA免疫沉淀测序（MeDIP-Seq）方法，分析来自肝脏肿瘤和脑肿瘤患者以及健康对照组的血浆cfDNA样本。
• 研究对称甲基化（symmetric methylation）和半甲基化（hemi-methylation）在肿瘤检测中的独立作用。

方案设计：

本研究通过分析肝癌患者、脑癌患者和健康对照者共计215例样本的cfDNA甲基化组图谱，并利用DMRs、DHMRs及两者结合训练机器学习模型。

开发两种甲基化DNA免疫沉淀和链特异性（strand-specific，ss）测序方法（MeDIP-Seq）：基于基因组DNA的ssg-MeDIP-Seq和基于血浆cfDNA的sscf-MeDIP-Seq。使用pA-Tn5转座酶进行DNA片段化和链特异性标记。

使用机器学习模型：训练并分析基于差异甲基化区域（DMRs）和差异半甲基化区域（DHMRs）的数据集。使用GLMnet、随机森林和深度神经网络（DNN）进行模型训练和验证。

研究亮点：

本研究结果揭示大多数DHMRs与相同样本中的DMRs不重叠，表明DHMRs可以作为独立的生物标志物。训练的机器学习模型结合DMRs和DHMRs显示出比单独使用DMRs或DHMRs更好的性能，尤其是在区分对照组、肝癌和脑癌方面。

表明利用DMRs和DHMRs作为生物标志物，通过sscf-MeDIP-Seq方法分析血浆cfDNA，可以提高多癌种检测的准确性。研究支持将cfDNA甲基化和半甲基化分析作为癌症早期检测和分类的潜在手段。

本研究创新性地开发了sscf-MeDIP-Seq方法，能够同时分析cfDNA的对称甲基化和半甲基化。证明了DHMRs作为独立生物标志物在肿瘤检测中的潜力。机器学习模型的结合使用DMRs和DHMRs提高了肿瘤检测的准确性（尤其是在独立验证队列中）。研究提供了一种新的策略，通过分析血浆cfDNA的甲基化模式来检测和分类肿瘤，具有潜在的临床应用价值。

结果图形：

（1）开发基因组甲基化DNA免疫沉淀与链特异性测序方法（ssg-MeDIP-Seq）

图 1：一种基于 pA-Tn5转座酶的MeDIP-Seq方法，用于以链特异性方式分析基因组DNA的甲基化组。

1. ssg-MeDIP-Seq程序，用于以链特异性方式分析基因组DNA的DNA甲基化。SM对称性甲基化，HM半甲基化。
2. 8个肝脏肿瘤样本与相应邻近非肿瘤组织（Adj-NT）之间的差异性甲基化区域（DMRs）热图。
3. 3个肝癌症样本及相应邻近非肿瘤组织（Adj-NT）样本中TBX2基因位点的肝脏肿瘤 DNA DMR。

d-e. 通过ssg-MeDIP-Seq鉴定的肝癌DMRs与TCGA肿瘤样本中通过450K甲基化芯片鉴定的DMRs进行重叠分析，通过小提琴图（d）和条形图（e）展示。

f. 肝癌DNA DMRs的序列元件富集分析。首先将 DMRs 与每个注释位点重叠，并与随机分布中的重叠数量进行比较，以计算Z分数。P值是通过单侧随机分布计算得出，没有进行多重比较校正。显著富集的序列元件用星号标记，黑色（高甲基化 DMR）和蓝色（低甲基化DMR），每个类别中的DMR数量在括号中显示。(p<0.05; **p<0.01; ***p<0.001)。

（2）肝脏肿瘤DNA的差异半甲基化区域（DHMRs）和差异甲基化区域（DMRs）可能是独立生物标志物

图2：通过ssg-MeDIP-Seq分析肝癌样本的DNA半甲基化。

1. 对称性甲基化（SM）和半甲基化（HM）示意图。SM指在Watson和Crick两条链上的CpG二核苷酸位点上等量DNA甲基化，而HM区域（HMR）指在一条链上的CpG位点相较于另一条链偏好性甲基化。
2. 两个肝脏肿瘤样本在C1QTNF4基因位点上的肿瘤DNA差异半甲基化区域（DHMR）快照，与其相应的邻近非肿瘤组织（Adj-NT）进行比较，阴影区域表示DHMR。
3. 肝脏肿瘤DNA HMRs的序列富集分析。
4. 8个肝脏肿瘤样本与其相应的Adj-NT相比的6864个DHMRs热图。HM水平以颜色从-1~1显示，其中有2330个肝脏肿瘤DNA DHMRs在Watson或Crick链上显示增加HM，而4534个DHMRs与对照组相比显示减少HM。
5. 8个肝脏肿瘤样本的DMRs和DHMRs与其相应的Adj-NT的重叠比较分析。
6. 与对照样本相比，增加（黑色）和减少（蓝色）的肝脏肿瘤DNA DHMRs的富集分析。
7. 与肝脏肿瘤DNA HMRs邻近基因的GO功能富集分析。
8. 与增加的HM相比，与Adj-NT对照样本中邻近肝脏肿瘤DNA DHMRs的GO功能富集分析。

以上结果表明肝脏肿瘤DHMRs和DMRs很可能是独立的生物标志物。

（3）开发用于分析cfDNA甲基化和半甲基化的sscf-MeDIP-Seq方法

图3：一种用于分析血浆cfDNA甲基化的单链cfDNA甲基化DNA免疫沉淀测序（sscf-MeDIP-Seq）方法

1. 用于分析cfDNA甲基化的sscf-MeDIP-Seq方法概述。SM对称性DNA甲基化，HM半甲基化。单链（ss）DNA上的DNA甲基化为半甲基化区域（HMR）。基于8个input样本，由ssDNA产生的HMR的数量可能很小。
2. TBX2基因位点的cfDNA DMR快照。阴影区域突出了10个肝脏肿瘤患者的cfDNA样本与10个对照组cfDNA样本的DMR，每组仅显示两个样本。还显示了两个未进行甲基化DNA免疫沉淀的input样本的序列reads片段。
3. 10个肝癌血浆样本和10个非肿瘤对照血浆样本的cfDNA DMR热图。

d-e. 小提琴图（d）和条形图（e）显示通过sscf-MeDIP-Seq鉴定肝脏肿瘤cfDNA DMRs与本研究中使用ssg-MeDIP-seq鉴定的肝脏肿瘤DNA DMRs之间的重叠。

f. 10个肝脏肿瘤样本和10个对照的血浆cfDNA DHMRs热图。

g. 与10个对照相比，10个肝脏肿瘤样本的血浆cfDNA DMRs和cfDNA DHMRs的重叠。

（4）大多数血浆cfDNA中的DHMRs与cfDNA中的DMRs不重叠，使用 DMR、DHMR 和 DMRs+DHMR 作为input训练的机器学习模型鉴定癌症类型

表1：本研究中使用的所有271个cfDNA样本的患者信息，包括癌症类型、性别和年龄

图4：使用DMRs和DHMRs以及机器学习模型进行多癌种检测。

1. 机器学习模型训练的流程图。使用单链cfDNA甲基化DNA免疫沉淀测序（sscf-MeDIP-Seq）分析了来自三组（对照组、脑癌和肝癌患者）的271个cfDNA样本甲基化组。215个sscf-MeDIP-seq数据集（占80%）被用作训练队列，剩余的56个（占20%）样本作为独立的验证队列。训练队列用于选择DMR和DHMR并训练机器学习模型，每个样本组使用DMR或DHMR作为训练input，结果产生了10个模型。基于DMR和DHMR的模型然后进一步统一构建最终的校准模型。然后使用训练有DMRs、DHMRs和DMRs+DHMRs作为input的模型评估验证队列。

b-d. 评估模型性能，预测验证队列中的对照组（b）、肝脏肿瘤（c）和脑肿瘤（d）cfDNA样本，使用训练有DMRs、DHMRs或DMRs+DHMRs的模型。每种预测的最高灵敏度和特异性点用红点标记。每个模型的AUC的95%置信区间在括号中标记。

e. 使用训练有DMRs+DHMRs的模型，每组样本的平均预测概率。每一列代表验证样本组，每一行代表模型预测。条形图显示为平均值+标准误差。红色、黄色和蓝色条分别代表20个脑癌、15个肝癌和21个健康对照样本概率。

（5）通过cfDNA甲基化组区分神经胶质瘤亚型

图5：使用sscf-MeDIP-Seq数据集预测脑肿瘤亚型。

1. 构建脑肿瘤亚型模型流程图。首先使用训练队列样本鉴定的DMR和DHMR训练IDH WT和IDH突变体神经胶质瘤模型，然后将这些模型与基于贝叶斯定理的三类模型（对照组、肝癌和脑肿瘤）结合，得出用于预测四个样本组的模型：IDH WT脑肿瘤和IDH突变体脑肿瘤、肝脏肿瘤和对照样本。
2. 训练DMR、DHMR、DMRs+DHMRs模型在验证队列中预测IDH突变体脑癌样本的评估。
3. 训练DMR、DHMR、DMRs+DHMRs模型在验证队列中预测IDH WT(野生型)脑癌样本的评估。
4. 使用训练DMRs+DHMRs模型，每组样本的平均预测概率。每一列代表验证队列中的样本组，每一行代表模型预测。条形图显示为平均值+标准误差。红色、粉色、黄色和蓝色条分别代表来自11个IDH突变体脑癌、9个IDH WT脑癌、15个肝癌和21个健康对照样本的概率。

（6）血浆cfDNA DMRs与肿瘤组织样本基因表达相关，这些基因表达能够预测患者生存率

图6：基于TCGA肝脏肿瘤组织中具有肝脏肿瘤特异性血浆cfDNA DMR邻近的基因表达对肝癌样本进行分类及患者生存预测。

1. 鉴定在启动子周围至少有一个肝癌cfDNA DMR且其在TCGA肝脏肿瘤组织样本中的表达与患者生存相关基因的流程。
2. 与至少一个cfDNA DMR邻近的150个基因周围的sscf-MeDIP-Seq信号密度。以颜色表示的z分数，是sscf-MeDIP-Seq信号的log2(RPKM)。"HyperDMR"至少有一个高甲基化cfDNA DMR邻近的基因，"HypoDMR"有一个低甲基化cfDNA DMR邻近的基因。
3. 基于上述鉴定的150个标记基因的表达，对TCGA-LIHC队列中的371个肝脏肿瘤样本进行分类。患者被分为两个聚类。颜色代表371个肝癌样本中150个基因的RNA-seq信号的log2(RPKM)的z分数。
4. 对(c)中分为两个聚类的371个肝癌患者进行Kaplan-Meier生存分析。P值通过logrank检验计算。

关于微量cfDNA甲基化测序（cfDNA-BS）技术

cfDNA片段化严重，片段大小常在150bp左右，现有甲基化检测技术包括cfMeDIP和微量WGBS等。无法做到碱基分辨、具有抗体特异性和非特异性捕获、覆盖深度低、检测成本高等特点。常规RRBS富集约70-350bp范围酶切片段，如对于CG含量高的片段将被切割的更碎而无法检测，保留下来的片段反而是CG含量低，无甲基化信息的基因片段。

技术优势：

• 超低起始量：100-500ul血浆或1ng cfDNA；
• 测序覆盖度高：20G测序数据，可达10M的CG位点覆盖，涵盖CpG岛、启动子、增强子、CTCF结合位点等多种核心调控区域
• 单碱基分辨率：在其覆盖范围内可精确分析每一个C碱基的甲基化状态；
• 性价比高：成本相对于现有技术大幅降低。

技术指标

应用场景：

• 癌前病变的癌变预警标志物检测
• 肿瘤早期筛查标志物检测
• 肿瘤预后标志物检测
• 药物疗效预测标志物检测

参考文献：

Hua X, Zhou H, Wu HC, Furnari J, Kotidis CP, Rabadan R, Genkinger JM, Bruce JN, Canoll P, Santella RM, Zhang Z. Tumor detection by analysis of both symmetric- and hemi-methylation of plasma cell-free DNA. Nat Commun. 2024 Jul 20;15(1):6113. pii: 10.1038/s41467-024-50471-1. doi: 10.1038/s41467-024-50471-1. PubMed PMID: 39030196.

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