两种参与茶树O-甲基化儿茶素生物合成的O-甲基转移酶的特征分析-文献精读20

Characterization of two O-methyltransferases involved in the biosynthesis of O-methylated catechins in tea plant

两种参与茶树O-甲基化儿茶素生物合成的O-甲基转移酶的特征分析

茶树三维基因组-文献精读19

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摘要

茶叶因其高含量的儿茶素而闻名，主要成分是(−)-表没食子儿茶素没食子酸酯（EGCG），具有显著的生物活性，包括潜在的抗癌和抗炎活性。然而，EGCG在肠道中的稳定性和渗透性差，削弱了这些健康益处。某些茶树品种中低含量的O-甲基化EGCG衍生物由于其增加的生物利用度而引起了极大的关注。在此，我们鉴定了来自茶树的两种O-甲基转移酶：CsFAOMT1具有对EGCG的3ʹʹ位特异性O-甲基转移酶活性，可生成EGCG3ʹʹMe，而CsFAOMT2主要催化EGCG4ʹʹMe的形成。在不同的茶树组织和种质中，CsFAOMT1和CsFAOMT2的转录水平与EGCG3ʹʹMe和EGCG4ʹʹMe的含量分别强烈相关。此外，CsFAOMT1和CsFAOMT2的晶体结构揭示了3ʹʹ和4ʹʹ-O-甲基化所需的关键残基。这些发现可能为未来开发高含量O-甲基化儿茶素的茶树品种提供指导。

介绍

茶是世界上最受欢迎的饮品之一。茶叶的独特风味和健康特性源于茶叶中多种生物活性化合物，如咖啡因和儿茶素（黄烷-3-醇）1。茶叶中的儿茶素占干重的12%以上，是一类具有生物活性的多酚类物质，其中(−)-表没食子儿茶素没食子酸酯（EGCG）是含量最丰富的成分2。大量研究表明，EGCG具有多种健康促进作用，包括抗癌3,4、抗炎5和心脏保护作用6，EGCG作为强效抗氧化剂或DNA甲基转移酶及多种信号通路的抑制剂6,7。然而，由于EGCG在肠道中性到碱性环境中的不稳定性导致其氧化，其治疗效果显著降低7。此外，多酚结构的高度极性使其难以穿透肠壁，进一步限制了其在人体内的生物利用度。

O-甲基化EGCG是指通过在EGCG的没食子酸部分的酚羟基上添加甲基形成的一系列甲基化衍生物（图1a）。在茶树中，天然甲基化主要发生在幼叶上，具体在EGCG的3″和4″位，分别生成EGCG3′′Me（(−)-表没食子儿茶素-3-O-(3-O-甲基)-没食子酸酯）和EGCG4″Me（(−)-表没食子儿茶素-3-O-(4-O-甲基)-没食子酸酯）8,9。在一项先前的研究中，我们调查了27种具有不同遗传背景的茶树种质中的EGCG3″Me和EGCG4″Me的含量，发现大约一半的种质中检测到EGCG3″Me，而EGCG4″Me仅在三个种质中检测到10。据报道，O-甲基化EGCG相比EGCG具有更好的稳定性、脂溶性、更高的口服生物利用度和更强的生物活性11。在大鼠中，口服给药后EGCG和O-甲基化EGCG的血浆浓度曲线显示，EGCG3″Me在血浆中的浓度比EGCG和EGCG4″Me高出七倍12。临床试验还表明，含有O-甲基化EGCG的茶（‘Benifuuki’）比不含O-甲基化EGCG的茶（‘Yabukita’）具有更强的抗过敏13和抗高血压14效果。

a. 主要O-甲基化儿茶素（EGCG3″Me和EGCG4″Me）的生物合成途径。SAM，S-腺苷-L-甲硫氨酸。OMT，O-甲基转移酶，SAH，S-腺苷-L-高半胱氨酸。 b. 火山图中基于SNP和InDel以及差异表达基因（DEGs）的ED4（欧几里得距离的四次方）值的染色体分布。以‘黄旦’基因组的染色体位置为横坐标，以ED4值为纵坐标，绘制RNA-seq SNP和InDel的ED4值的染色体得分。筛选DEGs的条件是|log2FoldChange | > 1和P < 0.05（双尾无配对检验）。 c. O-甲基转移酶的系统发育分析。所选OMTs的系统发育树：蓝桉CCoAOMT（O81185），甘尼桉CCoAOMT（O04854），烟草CCoAOMT（O24151），马铃薯CCoAOMT（Q8H9B6），茶树CCoAOMT（K9USP2），黑杨CCoAOMT（O65922），葡萄FAOMT（C7AE94），小麦FOMT（Q84N28），稻（日本亚种）COMT（Q6ZD89），美洲金露梅FOMT（Q42653），拟南芥COMT（Q9FK25），茶树COMT（E2FYC3），咖啡COMT（Q8LL87）。

EGCG3″Me的显著生物活性引起了人们对富含这种化合物的茶树的极大兴趣。尽管茶叶资源丰富2，但天然富含O-甲基化EGCG（>10 mg g−1）的茶树品种非常稀少15。此外，茶树通常在其生命周期中经历较长的幼年阶段，使得通过传统育种方法或基因改良开发新品种具有挑战性且耗时。茶树基因改良的另一个障碍是对EGCG O-甲基化的分子机制了解有限。先前的研究表明，O-甲基转移酶（OMT）可以催化O-甲基化EGCG的形成（图1a）16，并且已经成功从茶树中克隆出咖啡酰辅酶A O-甲基转移酶（CCoAOMT）17。然而，CCoAOMT的体外酶促反应产生了各种O-甲基化EGCG产品，包括EGCG3″Me、EGCG4″Me、(−)-表没食子儿茶素-3-O-(3,5-O-二甲基)-没食子酸酯和(−)-3-O-甲基-表没食子儿茶素-3-O-(3,5-O-二甲基)-没食子酸酯。这一发现与在茶树中检测到的主要O-甲基化EGCG是EGCG3″Me和EGCG4″Me的事实相矛盾，表明负责3″和4″位O-甲基化的真正OMT尚未被鉴定。

在本研究中，我们从茶树中鉴定出两种O-甲基转移酶（CsFAOMT1和CsFAOMT2）。CsFAOMT1在EGCG的3″位表现出特异的O-甲基转移酶活性，不同组织和不同遗传背景的茶树中EGCG3″Me的水平与CsFAOMT1的转录水平密切相关；而CsFAOMT2可在3″和4″位甲基化EGCG，其中EGCG4″Me是主要产物。CsFAOMT1和CsFAOMT2的晶体结构结合体外酶促研究揭示了3″和4″-O-甲基化所需的关键残基。这些结果可能为未来培育高含量O-甲基化EGCG的茶树和开发新茶产品提供指导。

结果

从茶树克隆候选O-甲基转移酶基因

我们首先旨在鉴定‘金萱’（JX）和‘紫娟’（ZJ）这两个含有EGCG3″Me的著名中国茶树品种中EGCG3″Me生物合成的关键基因。为此，我们对JX和ZJ的F1代群体进行了群体分离RNA测序（BSR-Seq）18。从F1代群体中选择了24个EGCG3″Me含量高（>5 mg g−1）和24个EGCG3″Me含量低（<0.1 mg g−1）的个体，形成两个极端组（组H/L）。在Illumina NovaSeq平台上进行了BSR-Seq分析，识别出大约250,000个单核苷酸多态性（SNPs）或插入/缺失（InDels）。我们发现与该性状相关的变异在‘黄旦’参考基因组（GWHAZTZ00000004）第6号染色体上的一个大约46 Mb的区域内富集19，表明目标基因可能位于该区域（图1b）。此外，鉴定出217个差异表达基因（DEGs），包括94个上调DEGs和123个下调DEGs。在94个上调DEGs（补充数据1）中，有5个DEGs（HD.03G0010060、HD.03G0009980、HD.03G0009970、HD.03G0009860、HD.06002937）是位于第6号染色体识别区域的假定OMTs。为了确定目标OMT，对27个具有不同遗传背景的茶树种质进行了RNA-seq分析，以分析包括这5个OMTs在内的35,628个茶树基因的转录水平与EGCG3″Me水平之间的相关性（补充数据2）。最终，我们发现表达较高水平OMT（HD.03G0010060）的茶树往往含有更多的EGCG3″Me，表明两者之间存在正相关（R = 0.89，P = 2.75 × 10−28）。

为了阐明候选OMT的序列，我们设计引物并从JX的cDNA中克隆编码区，编码一个236个氨基酸的蛋白质（补充图1）。有趣的是，使用相同的引物，我们还从JX的cDNA中分离出一个新的O-甲基转移酶基因，该基因未在所有已报道的茶树参考基因组中发现19,20,21,22,23,24。考虑到JX还积累了EGCG4″Me10，我们认为该基因可能负责EGCG4″Me的生物合成。对这两个O-甲基转移酶与植物中其他O-甲基转移酶的系统发育分析表明，它们与葡萄中的黄酮醇和花青素O-甲基转移酶（FAOMT）密切相关，而与茶树的CCoAOMT相对较远（图1c）17。因此，这两个O-甲基转移酶分别被命名为CsFAOMT1和CsFAOMT2。

CsFAOMT1的表达与EGCG3″Me含量密切相关

接下来，我们研究了CsFAOMT1的组织特异性表达模式和EGCG3″Me水平。CsFAOMT1在幼叶中的转录水平最高，其次是花蕾，而在成熟叶、花、老叶、根和种子中的转录水平较低（图2a，b）。一致地，高水平的EGCG3″Me在幼叶中被检测到，其次是花蕾、成熟叶、花和老叶，而在根和种子中由于EGCG前体含量低（补充表2）和CsFAOMT1的低转录水平（图2c），EGCG3″Me的含量不可检测。一个例外是成熟叶，其EGCG3″Me含量与花蕾相似，表明EGCG3″Me含量在叶片老化过程中逐渐减少。此外，来自F1代群体的20个个体（图2d）和具有不同遗传背景的27个茶树种质（图2e）的定量实时PCR（qRT-PCR）结果证实，CsFAOMT1的转录水平与EGCG3″Me的积累显著正相关。

a. 茶树的不同组织。 b, c. 不同组织中CsFAOMT1的相对转录水平 (b) 和EGCG3″Me的含量 (c)。数据表示三个样本的平均值±标准偏差。对应的点状图叠加在图上。实验重复两次，结果相似。柱子上方的不同字母表示通过单因素方差分析（one-way ANOVA）在P < 0.05（对于(a)和(b)分别为P = 2.77 × 10^−9和P = 1.62 × 10^−15）水平下组织间存在显著差异。 d. CsFAOMT1转录水平与F1群体中20个个体EGCG3″Me含量的相关性。 e. CsFAOMT1转录水平与27种茶树种质中EGCG3″Me含量的相关性。 f. F1群体中四种CsFAOM1基因型在两个季节的EGCG3″Me含量差异。EGCG3″Me含量已在我们之前的研究中通过UPLC鉴定18。R2表示解释的表型变异百分比。不同字母表示通过单因素方差分析在P < 0.05水平下基因型之间存在显著差异。

基于CsFAOMT1启动子序列，我们设计了引物对并克隆了该基因。从JX×ZJ F1群体的个体中鉴定出四种基因型，命名为A–D（补充图2）。四种基因型的EGCG3″Me含量显著不同：基因型A的EGCG3″Me含量最高，大约是基因型B和基因型C的两倍，而它们都显著高于基因型D，后者的EGCG3″Me几乎不可检测（图2f）。CsFAOMT1基因型可以解释春季和秋季EGCG3″Me含量变化的87%以上。这些结果表明，CsFAOMT1是调控EGCG3″Me生物合成的关键候选基因。

CsFAOMT1对EGCG具有特异的3″-O-甲基转移酶活性

为了鉴定CsFAOMT1的酶活性，使用在大肠杆菌中表达的重组蛋白进行了体外甲基化实验，随后对产物进行超高效液相色谱（UPLC）和液相色谱质谱（LC-MS）分析。如图3a所示，CsFAOMT1在依赖Mg2+的情况下表现出显著的3″-O-甲基转移酶活性，将EGCG转化为EGCG3″Me。在UPLC中，仅观察到一个产物，其保留时间与标准EGCG3″Me相同。LC-MS/MS分析进一步验证了该产物具有与EGCG3″Me相同的MS2碎片离子，其中一个m/z值为167.09的碎片支持D环上存在一个甲基基团（补充图3）。为了确认CsFAOMT1确实在体内负责EGCG3″Me的生物合成，将EGCG注入瞬时表达CsFAOMT1的烟草（Nicotiana benthamiana）叶片中。如预期，通过UPLC-MS分析从注入EGCG的叶片中检测到EGCG3″Me（图3b）。总体而言，这些结果表明CsFAOMT1是EGCG的特异3″-O-甲基转移酶。

a. 使用含有过表达CsFAOMT1的细胞裂解液进行体外O-甲基转移酶活性分析，以EGCG为底物，并以空载体（EV）为阴性对照。反应产物通过UPLC分析，吸收波长设置为280 nm。该实验重复了两次。 b. CsFAOMT1的体内O-甲基转移酶活性分析。通过质谱检测到瞬时转基因CsFAOMT1烟草叶片中的EGCG3″Me（473→139），以含有EV的转基因烟草叶片作为对照。向三片烟草叶片的背面均匀注射2.0 mL的10 mM EGCG，两天后收集样品并分析O-甲基化EGCG的含量。

CsFAOMT2对EGCG具有4″-O-甲基转移酶活性

CsFAOMT2仅能从含有EGCG4″Me的茶树cDNA中分离得到（图4a, b）。类似于CsFAOMT1的转录水平与EGCG3″Me的相关性，发现CsFAOMT2的转录水平也与F1群体（图4c）、27个茶树种质资源（图4d）和茶树不同组织（图4e, f）中积累的EGCG4″Me的含量正相关。体外酶促试验使用重组CsFAOMT2蛋白确认，CsFAOMT2主要对EGCG具有4″-O-甲基转移酶活性，并且具有较低的3″-O-甲基转移酶活性（图4g和补充图3）。此外，在反应溶液中观察到少量的双甲基化EGCG产物（EGCGdi-Me1和EGCGdi-Me2），并通过LC-MS/MS分析进一步验证（图4g和补充图3）。两个产物均显示出一个m/z值约为181的MS2碎片，支持双甲基化发生在D环上。然而，由于缺乏3″,4″-二甲基EGCG和3″,5″-二甲基EGCG的标准样品，我们无法区分它们。

a. JX × ZJ F1群体中含有CsFAOMT2（存在）和缺乏CsFAOMT2（缺失）的十个个体之间EGCG4″Me含量的差异。表示通过双尾Student's t检验在P < 0.001（P = 1.06 × 10^−5）水平下两组之间存在显著差异。 b. 27个具有不同遗传背景的茶树种质中，含有CsFAOMT2（存在）的三个品系与缺乏CsFAOMT2（缺失）的24个品系之间EGCG4″Me含量的差异。表示通过双尾Student's t检验在P < 0.001（P = 1.83 × 10^−10）水平下两组之间存在显著差异。 c. F1群体中含有CsFAOMT2（存在）的十个个体与缺乏CsFAOMT2（缺失）的十个个体之间CsFAOMT2转录水平的差异。***表示通过双尾Student's t检验在P < 0.001（P = 2.87 × 10^−15）水平下两组之间存在显著差异。 d. 27个茶树种质中CsFAOMT2转录水平与EGCG4″Me含量之间的相关性分析。 e, f. 不同组织中CsFAOMT2相对转录水平（e）和EGCG4″Me含量（f）。数据表示三个样本的平均值±标准偏差。对应的点图叠加在图上。实验重复两次。不同字母表示通过单因素方差分析在P < 0.05（e为P = 1.96 × 10^−10，f为P = 2.87 × 10^−15）水平下组织间存在显著差异。 g. 使用细胞裂解液进行CsFAOMT2的体外O-甲基转移酶活性分析，以EGCG为底物，空载体（EV）为阴性对照。反应产物通过UPLC分析，吸收波长设置为280 nm。标记了两种双甲基化EGCG（EGCGdi-Me1和EGCGdi-Me2）。

a (−)-表儿茶素 (EC, 0.4 mM); b (−)-表儿茶素没食子酸酯 (ECG, 0.4 mM); c 没食子酸 (0.4 mM); d 甲基没食子酸 (0.4 mM); e 咖啡酸 (0.2 mM); f 异槲皮苷 (0.2 mM); g 紫杉醇 (0.4 mM); h 花青素3-O-半乳糖苷 (0.2 mM)。 EV 空载体。产品及其标准化合物的MS/MS数据在补充图5和补充表3中列出。

为了进一步验证CsFAOMT1和CsFAOMT2的O-甲基化活性，使用EGCG作为底物进行了动力学分析。首先，我们研究了最佳反应条件，发现CsFAOMT1在pH 7.4和40 °C、存在1.0 mM Mg2+的条件下具有最高活性（补充图5a）。CsFAOMT2的最佳反应条件为pH 7.6和45 °C（补充图5b）。在最佳条件下，使用在大肠杆菌中表达的高纯度重组蛋白，在饱和的S-腺苷-L-甲硫氨酸（SAM）浓度（分别为3和4 mM）下，测定CsFAOMT1和CsFAOMT2对EGCG的Km参数（补充图6）。Km值，CsFAOMT1为95.79 μM，CsFAOMT2为20.88 μM，表明CsFAOMT2对EGCG的亲和力比CsFAOMT1更强（图5和补充表4）。此外，CsFAOMT2的kcat/Km值（6762.45 s−1 M−1）高于CsFAOMT1（3830.57 s−1 M−1），表明CsFAOMT2具有更高的催化效率。

通过测定CsFAOMT1和CsFAOMT2对ECG、没食子酸、甲基没食子酸、咖啡酸、异槲皮苷、紫杉醇和花青素3-O-半乳糖苷的动力学常数，进一步表征了它们的底物偏好（图6）。鉴于较高SAM浓度的明显抑制效应，CsFAOMT1对咖啡酸、异槲皮苷和花青素3-O-半乳糖苷的动力学分析在较低饱和SAM浓度（1 mM）下进行（补充表5），而CsFAOMT2对ECG、没食子酸、咖啡酸、异槲皮苷和花青素3-O-半乳糖苷的测定在存在2 mM SAM的情况下进行（补充表6）。结果显示，与EGCG相比，CsFAOMT1对ECG表现出更高的亲和力和显著更高的效率，反映在较低的Km值和较高的kcat/Km值上（图6a, b和补充表4）。然而，茶树中ECG3″Me的含量与EGCG3″Me呈正相关，但显著低于EGCG3″Me，这可能是因为ECG的含量较低。CsFAOMT1对甲基没食子酸和紫杉醇表现出低Km值（<4 μM）和高kcat/Km值（kcat/Km > 39,000 s−1 M−1），表明对这两种底物具有强烈的特异性活性。对于异槲皮苷，观察到相当高的Km值（>2500 μM），导致催化效率较低（kcat/Km = 225.72 s−1 M−1）。相比之下，CsFAOMT2对这七种底物的Km（10.06–144.50 μM）范围较窄，kcat（28.54–623.43 × 10−3 S−1）范围较宽（图6和补充表4）。对于CsFAOMT2，ECG的动力学参数与EGCG相似（图6a, b）。以花青素3-O-半乳糖苷为底物时，观察到较低的kcat（28.54 ± 3.06 × 10−3 S−1）和kcat/Km值（361.95 s−1 M−1），表明催化效率较弱。

分别使用EGCG (a)、ECG (b)、没食子酸 (c)、甲基没食子酸 (d)、咖啡酸 (e)、异槲皮苷 (f)、紫杉醇 (g) 和花青素3-O-半乳糖苷 (h) 作为底物。图中的数据是三个重复样本的平均值 ± 标准差。黑线表示初始速度与底物浓度的非线性最小二乘拟合到双曲线Michaelis–Menten方程。CsFAOMT1和CsFAOMT2的动力学参数在饱和浓度下测定。

CsFAOMT1和CsFAOMT2的晶体结构揭示了底物识别的关键残基

为了解释CsFAOMT1和CsFAOMT2的特异性，我们在EGCG和S-腺苷-L-高半胱氨酸（SAH）存在下结晶了两者，并确定了CsFAOMT1和CsFAOMT2的结构，分辨率均为2.0 Å（补充图7和补充表7）。这两种结构都表现出典型的Rossmann折叠和二聚体排列，类似于其他阳离子依赖性OMTs26。SAH和Mg2+的电子密度被明确分配，但在任何结构中都未找到EGCG。CsFAOMT1和CsFAOMT2单体的结构重叠显示，190个对齐残基的Cα原子上的均方根偏差为0.36 Å，最显著的差异发生在靠近底物结合口袋的一个α螺旋（α9）处（图7a）。在CsFAOMT1中，这个α螺旋向口袋弯曲，形成一个深且窄的裂缝用于底物结合，而在CsFAOMT2中，相应的α螺旋向相反方向弯曲，导致一个相对开放且浅的口袋。与其他O-甲基转移酶的比较表明，CsFAOMT1和CsFAOMT2与三种植物来源的O-甲基转移酶具有高度的结构相似性：来自晶质冰草的苯丙烷和黄酮类O-甲基转移酶（McPFOMT）（PDB代码3C3Y）26以及来自紫花苜蓿的两个CCoAOMT（PDB代码1SUI）27和高粱（PDB代码5KVA）28。所有这些结构都包含一个在Rossmann折叠之前的N端臂，这被证明对底物结合至关重要。此外，弯曲的α螺旋存在于所有这些植物O-甲基转移酶中，并且比其他阳离子依赖性O-甲基转移酶（如细菌和动物中的儿茶酚O-甲基转移酶（COMT）和类似CCoAOMT）中的相应螺旋更长29,30,31（补充图8）。序列比对也支持CsFAOMTs与植物来源O-甲基转移酶之间的密切关系，序列同一性超过53%，远高于CsFAOMTs与细菌和动物中的其他OMTs之间的低于35%（补充图9）。

a. CsFAOMT1和CsFAOMT2的结构重叠。CsFAOMT1和CsFAOMT2分别用浅青色和蓝色表示。Mg2+显示为棕色球体。SAH显示为球棍模型。 b. 使用EGCG作为底物的CsFAOMT1和CsFAOMT2突变体的体外甲基化实验。数据表示平均值±标准差（n = 4）。对应的点图叠加在图上。实验重复了两次。差异通过双尾Student's t检验进行统计评估。**P < 0.01。 c–e. CsFAOMT1 (c)、CsFAOMT1-Y184R (d) 和 CsFAOMT1-L50M (e) 的底物结合口袋中的EGCG和SAM的分子对接。EGCG的D环、3″和4″位置标记出来。侧链显示为棒状。

考虑到CsFAOMT1和CsFAOMT2的序列同一性超过90%（补充图1），它们的不同位置偏好可能是由于一些微小的可变残基细微影响了局部化学环境或构象。我们特别注意了Mg2+周围的残基，因为它们可能在协调EGCG的D环并将目标羟基与Mg2+对齐方面发挥关键作用。这一步对于离子化羟基对SAM甲基基团的后续攻击至关重要。随后鉴定了两个序列可变残基：CsFAOMT1-L50（CsFAOMT2-M50）和CsFAOMT1-Y184（CsFAOMT2-R184）（补充图7c）。使用CsFAOMT1和CsFAOMT2突变体进行了体外酶促实验，交换这两个残基，使用野生型CsFAOMT1和CsFAOMT2作为对照（图7b）。有趣的是，CsFAOMT1-L50M和CsFAOMT1-Y184R在3″-O-甲基化活性上产生了完全不同的结果：CsFAOMT1-L50M中等增加，而CsFAOMT1-Y184R显著减少；当CsFAOMT1-L50M结合时，CsFAOMT1-Y184R的活性可增加约两倍（172%），但仍远低于野生型CsFAOMT1。然而，CsFAOMT1-Y184R获得了甲基化EGCG 4″位置的能力，其活性约为CsFAOMT2的25%。当CsFAOMT1-L50M加入时，CsFAOMT1-Y184R的4″-O-甲基化活性可以进一步增加，尽管CsFAOMT1-L50M单独显示没有4″-O-甲基化活性。与之相一致，CsFAOMT2-R184Y导致3″-甲基化活性显著增加，EGCG 4″-位置的甲基化能力适度下降，结合M50L突变时，CsFAOMT2-R184Y的3″-和4″-O-甲基化活性分别减少了58%和54%（图7b）。

为了明确这些残基在底物结合中的确切作用，我们将SAH替换为SAM，然后将EGCG对接到CsFAOMT1的结构中。EGCG嵌入由两个α螺旋、α3和弯曲的α螺旋α9形成的狭窄而深的裂缝中，A环和B环通过氢键锚定（图7a和补充图10）。简而言之，来自α3的Y46与A环上的7-OH相互作用。对于B环，K156和来自α9的两个残基，R197和S201，分别识别3′-、4′-和5′-OH。我们还将EGCG对接到通过同源建模生成的CsFAOMT1-L50M和CsFAOMT1-Y184R结构中。值得注意的是，CsFAOMT1-Y184和CsFAOMT1-Y184R都可以与没食子酸部分的羰基形成氢键，从而将D环定位到活性位点，这可能解释了CsFAOMTs对EGCG D环的特异性。区别在于CsFAOMT1-Y184有助于将D环上的3″-羟基定位在靠近SAM的甲基基团的位置（图7c）；用具有较长侧链的精氨酸替换酪氨酸将D环推入更深的口袋中，导致3″-羟基被4″-羟基取代，靠近SAM的甲基基团（图7d）。CsFAOMT1-L50M突变不会引发EGCG的移动（图7e）。相反，它可能有助于稳定结合口袋中的EGCG没食子酸部分，从而增加CsFAOMT1和CsFAOMT1-Y184R的3″-甲基化活性。此外，我们发现CsFAOMT1中靠近EGCG的5″-OH的一个亲水残基E49可能通过水介导的氢键参与识别（补充图10和11），这解释了为什么CsFAOMT1仅生成EGCG3″Me。然而，在CsFAOMT2中，这个残基突变为疏水缬氨酸（V49），使其能够容纳5″-OMe并导致生成二甲基EGCG。

CsFAOMT1和CsFAOMT2的位置特异性分别让人联想到McPFOMT26和SynOMT31。当使用3,4,5-三羟基肉桂酸作为底物时，McPFOMT仅在邻位-OH（3-OH）上进行O-甲基化，而SynOMT可以甲基化邻位和对位-OH（4-OH）基团。它们活性位点的比较揭示了与CsFAOMT1-Y184等价物相似的作用：就像将CsFAOMT1中的Y184替换为CsFAOMT2中的R184一样，PFOMT中的G185被SynOMT中的H174取代，将4-OH基团推得更靠近Mg2+（补充图11）。

讨论

O-甲基化儿茶素由于其比其母体化合物更稳定、生物利用度更高且更有效，而受到广泛关注。然而，茶树中天然O-甲基化儿茶素的含量相对较低，难以充分利用其健康促进效果。大规模栽培含高水平O-甲基化儿茶素的茶树以汇聚茶种质中的优良基因可能是一种有效措施，但需要更多关于参与O-甲基化儿茶素生物合成的酶的信息。在本研究中，我们鉴定了具有3″-位甲基化活性的CsFAOMT1和在没食子化黄烷-3-醇（EGCG和ECG）4″-位上具有主导甲基化活性的CsFAOMT2。此外，我们发现茶树中EGCG3″Me和EGCG4″Me的水平与CsFAOMT1和CsFAOMT2的转录水平正相关。通过聚集具有高转录水平的CsFAOMT1和CsFAOMT2优良等位基因，未来可能创新出含有更高水平O-甲基化儿茶素的优良茶种质。CsFAOMT1和CsFAOMT2的晶体结构结合体外酶促实验揭示了催化过程中区分EGCG 3″-和4″-位的关键残基。随着茶树基因转化技术的成熟，这些信息将有助于理性地修改O-甲基转移酶以育成含高水平O-甲基化EGCG的新茶品种。因此，本研究为未来高含量O-甲基化儿茶素茶树的育种提供了重要线索。

底物结合和特异性在植物O-甲基转移酶中引起了极大的兴趣，因为它们参与了具有多种结构和生物学意义的多种化合物的生物合成。将CsFAOMT1中的单个残基（Y184）与CsFAOMT2中的对应残基（R184）交换似乎足以赋予CsFAOMT1明显的4″-甲基转移酶活性，尽管该活性远低于CsFAOMT2。值得注意的是，精氨酸的侧链比酪氨酸更灵活，这意味着EGCG在CsFAOMT2和CsFAOMT1-Y184R突变体的活性位点可能以更动态的方式结合，从而赋予它们3″-和4″-O-甲基化活性。底物结合口袋周围的其他残基也可能对位置特异性做出贡献，特别是那些位于弯曲的α螺旋上的残基。O-甲基转移酶的特异性是多种因素相互作用的结果，不仅仅是酶本身的原因。这些因素还包括底物的分子结构和性质，以及反应条件，但可能不限于这些特性。未来的工作需要了解CsFAOMT1中如何实现这一点，这对于利用EGCG的次生代谢至关重要。

方法

化学试剂

S-腺苷-L-甲硫氨酸（SAM）购自盛工（上海，中国）。没食子酸、EC、(−)-表儿茶素、ECG和EGCG购自Sigma-Aldrich（圣路易斯，美国）。ECG3″Me、ECG4″Me、EGCG3″Me和EGCG4″Me购自Nagara Science Co., Ltd.（岐阜，日本）。紫杉醇和檀香素购自BioBioPha Co., Ltd（昆明，中国），咖啡酸、阿魏酸、异阿魏酸、3-O-甲基没食子酸、4-O-甲基没食子酸、甲基没食子酸、甲基4-O-甲基没食子酸、花青素3-O-半乳糖苷氯化物、芍药苷3-O-半乳糖苷氯化物、异槲皮苷、异鼠李素3-O-葡萄糖苷和丁香苷购自上海源叶生物科技有限公司（上海，中国）。细毛果和松萝酚购自ChemFaces（武汉，中国）。甲基3-O-甲基没食子酸购自MedChemExpress（Monmouth Junction，美国）。3′,4′-二甲基乙醇提供者为山东大学陈爱霞教授（中国）。

植物材料

本研究使用了由150多个F1个体组成的杂交群体。该群体通过使用‘金萱’（Camellia sinensis var. sinensis，JX）和‘紫娟’（C. sinensis var. assamica，ZJ）进行人工杂交构建。从杂交群体中的每个个体及其父母中采集“一个芽一个叶”的嫩枝。此外，选择了27种具有广泛遗传变异的茶树种质资源，这些资源含有O-甲基化儿茶素10。采集的不同组织样品（芽、叶、花、根和种子）来自雄性亲本JX，并立即存储在−80 °C。材料用于基因组DNA和RNA的提取以及儿茶素的分析。用于瞬时转化的烟草为N. benthamiana。

茶树儿茶素分析

将样品，包括茶叶、芽、叶、花、根和种子，冻干并用RETSCH MM400研磨机以25-30 r min−1的速度研磨2分钟。每个样品组织约0.1克浸泡在10毫升70%（v/v）甲醇（Thermo Fisher，美国）中超声波处理30分钟，然后在4 °C下静置2小时。上清液通过0.22 μm尼龙过滤器过滤，然后在UPLC系统（H-Class，Waters，美国）上进行LC-MS/MS分析，结合三重四极杆质谱仪（TQS-Micro，Waters，美国）。茶叶代谢物的色谱分离在ACQUITY UPLC HSS T3 C18柱（1.8 μm，2.1 mm×100 mm，Waters，美国）上进行，使用0.1%（v/v）甲酸（TIC，东京，日本）作为A相和乙腈（Thermo Fisher，美国）作为B相。色谱洗脱设置如下：0分钟，2% B；5分钟，2% B；10分钟，10% B；15分钟，20% B；17分钟，25% B；17.1分钟，100% B；18.6分钟，100% B；18.7分钟，2% B；20分钟，2% B。流速设置为0.28毫升/分钟。注射体积为1 μL。电喷雾离子化（ESI）在正离子化模式下进行，参数如下：毛细管电压设置为3 kV；离子源温度设置为600 °C；锥形气体和溶剂化气体的流速分别设置为50和600 L/h。优化的多反应监测转换和碰撞能量电压显示在补充表8中。使用相应标准溶液的校准曲线对代谢物进行绝对定量。最近在中国福建发现的茶树基因资源红芽茶（HYC）也含有GCG3″Me和GCG4″Me。

RNA-seq分析

按照EASY-spin Plus Complex Plant RNA kit（艾德生物技术公司，北京，中国）的生产商协议提取总RNA，然后使用NanoDrop（Thermo，Waltham，MA）进行测量。转录组测序由上海派森生物技术有限公司完成。使用Illumina NovaSeq平台（Illumina，San Diego，CA，USA）进行RNA-seq实验。从JX × ZJ F1群体中选择24个高EGCG3″Me含量（>5.0 mg g^−1）和24个低EGCG3″Me含量（<0.1 mg g^−1）的个体，形成两个极端组（H组和L组）并进行BSR-Seq分析。每组中的8个个体的总RNA等量混合并作为一个生物重复（H1、H2、H3池，L1、L2、L3池）进行处理。对每个RNA池进行RNA-seq。以‘黄旦’为参考基因组，根据两组间的基因表达差异并结合目标性状图谱结果确定初步候选基因。通过DESeq（1.30.0）分析基因表达水平不同的基因。SNP的检测主要通过GATK软件工具包进行。使用批量RNA-seq的读取数据计算欧几里得距离（ED）进行批量分离分析。此外，选择27个具有多样性遗传背景的茶树种质资源进行RNA-seq并筛选关键候选基因。基于皮尔逊相关性计算基因表达与EGCG3″Me含量之间的相关性。

CsFAOMTs基因序列克隆

按照FastKing cDNA First-Strand合成试剂盒（天根）的说明，使用200 ng RNA合成第一链cDNA。筛选候选基因，并根据5′非翻译编码区（UTR）和3′UTR的序列设计两对引物（补充表1）。使用KOD-Pus-Neo（TOYOBO）在50 μL反应体系中进行PCR。PCR产物在0.8%的琼脂糖凝胶上检测。随后，通过同源重组将目标基因连接到pUCm-T载体中并转入大肠杆菌（DH5α）进行序列验证。参考CsFAOMT1启动子序列设计用于基因型鉴定的引物对（补充表1），通过直接测序PCR产物并检测启动子中出现的SNP对群体中的每个个体进行基因分型。

系统发育分析

使用MEGA X软件（Home）生成邻接树。CsFAOMT1和CsFAOMT2同源物的氨基酸序列从国家生物技术信息中心和通用蛋白数据库（NCBI，National Center for Biotechnology Information，UniProt，UniProt）中检索，并使用CLUSTALW（Multiple Sequence Alignment - CLUSTALW）进行比对。

CsFAOMTs在茶树中的转录水平分析

实施qRT-PCR以检测不同茶树和不同组织中的CsFAOMTs转录水平。使用LightCycler® 480系统和LightCycler® 480 SYBR Green I Masterkit（罗氏公司，曼海姆，德国）检测转录水平。qRT-PCR扩增程序为：98 °C 2分钟，接着45个循环：94 °C 10秒，58 °C 15秒，72 °C 12秒。使用Cs18S作为内参基因，使用2−ΔΔCT方法计算相对基因表达量。所有引物列于补充表1。

烟草中的瞬时表达

CsFAOMT1和CsFAOMT2克隆到35S-GFP载体中，然后转化到农杆菌GV3101菌株中。将约100 μL农杆菌转入10 mL液体LB培养基中扩增至OD600值为1.0–1.2。通过离心收集沉淀，然后注射到烟草叶片中。瞬时转基因烟草培养两天后，将2.0 mL 10 mM EGCG注射到三片烟草叶片的背面，两天后收集样品并分析O-甲基化EGCG含量。

蛋白质纯化

用于体外酶促活性和动力学分析：使用ClonExpress® II One Step Cloning Kit（Vazyme Biotech Co., Ltd., Nanjing）将编码CsFAOMT1和CsFAOMT2的基因克隆到pMAL-c5x中。质粒转入BL21（DE3）pLys细胞（TransGen Biotechnologies Co., Beijing, China）以表达含有N端MBP标签的目标蛋白。细胞在37 °C培养3–4小时，直到细胞密度达到OD600 0.6，通过加入0.5 mM异丙基β-D-1-硫代半乳糖苷（IPTG）诱导蛋白表达，并在37 °C下再培养4–6小时。收获细胞，重悬于缓冲液1（20 mM Tris-HCl，pH 7.4，1.0 mM EDTA，1.0 mM DTT，200 mM NaCl，10%（v/v）甘油）中，通过超声破碎（225 W，10分钟）。使用MBP标记的淀粉树脂（New England Biolabs，NEB）纯化重组蛋白，并通过缓冲液2（20 mM Tris-HCl，pH 7.4，1.0 mM EDTA，1.0 mM DTT，200 mM NaCl，10%（v/v）甘油和10 mM麦芽糖）洗脱。

用于结晶和结构测定：将编码CsFAOMT1和CsFAOMT2的基因分别插入修饰的pRSF-Duet1载体中，其中在多克隆位点前插入了His6-SUMO标签。当细胞密度达到OD600 1.0时，通过加入IPTG至最终浓度0.4 mM，在16 °C过夜培养BL21（DE3）细胞，过表达重组蛋白。收获细胞，重悬并裂解于缓冲液A（50 mM Tris，pH 8.0，1 M NaCl，25 mM咪唑和5 mM β-巯基乙醇）中。首先通过镍柱纯化His6-SUMO标记的蛋白，然后通过ULP1裂解标签。进一步通过阴离子交换层析（Hitrap Q，GE Healthcare）和大小排阻层析（Superdex 75 16/600，GE Healthcare）分级目标蛋白。蛋白质浓缩至约20 mg mL^−1在缓冲液B（25 mM Tris，pH 8.0，100 mM NaCl和5 mM DTT）中并储存于−80 °C以备将来使用。

CsFAOMTs的体外测定

体外酶促活性测定在pH 7.4和40 °C下进行30分钟。简而言之，200 μL反应混合物含有100 mM Tris-HCl（pH 7.4），0.5 mM SAM，4 mM DTT，0.2 mM或0.4 mM底物，1 mM MgCl2和50 μL粗重组蛋白。通过加入等体积的200 mM HCl（含10%甲醇和10%二甲基亚砜）停止反应。使用pMAL-c5x空载体作为阴性对照。反应混合物离心去除沉淀（2分钟，12,000 r min^−1），然后使用与我们之前研究相同的UPLC-UV检测方法分析10 μL上清液。相比之下，异槲皮苷和紫杉醇的色谱洗脱设置如下：0分钟，15% B；15分钟，70% B；15.1分钟，100% B；16.5分钟，100% B；16.6分钟，15% B；18分钟，15% B。流速设置为0.4 mL/分钟。在280 nm（EC，ECG，EGCG，没食子酸和甲基没食子酸），320 nm（咖啡酸），360 nm（异槲皮苷和紫杉醇）和520 nm（花青素3-O-半乳糖苷）波长下进行紫外检测。

重组蛋白的最佳反应条件通过评估不同反应温度、时间、pH值、离子和SAM浓度对EGCG底物的影响来确定。根据产物的峰面积计算酶的催化效率。CsFAOMT1和CsFAOMT2野生型和突变体的体外酶促活性测定最终在pH 7.4和40 °C下进行10分钟。简而言之，200 μL反应混合物含有100 mM Tris-HCl（pH 7.4），3 mM SAM，4 mM DTT，0.4 mM EGCG，1 mM MgCl2和5 μg纯化重组蛋白。

通过LC–MS/MS鉴定重组CsFAOMT1和CsFAOMT2产生的反应产物使用与茶树儿茶素分析相同的仪器和色谱洗脱条件。相比之下，异槲皮苷和紫杉醇的色谱洗脱条件与用于UPLC-UV的相同。注射体积为10 μL。ESI在正离子或负离子化模式下进行，参数如下：毛细管电压设置为3.5 kV；离子源温度设置为500 °C；锥形气体和溶剂化气体的流速分别设置为50和1000 L/h。碰撞能量电压显示在补充表9中。

动力学分析

在最佳条件下测定CsFAOMTs的动力学参数，并在200 μL最终体系中进行反应，含有1 μg纯化酶（除了在测试紫杉醇、甲基没食子酸和花青素3-O-半乳糖苷时分别使用0.1、0.2和3 μg CsFAOMT1；在测试紫杉醇和花青素3-O-半乳糖苷时分别使用0.5和3 μg CsFAOMT2）和不同浓度的底物10分钟（除了花青素3-O-半乳糖苷30分钟）。所有反应产物使用UPLC-UV系统分析。酶动力学参数（Km、Vmax、kcat、kcat/Km）通过GraphPad Prism 8使用非线性回归分析的Michaelis–Menten方程分析。

结晶和结构测定

CsFAOMT1和CsFAOMT2的结晶分别在4 °C和16 °C使用悬滴扩散法进行。蛋白质与1 mM SAH、10 mM EGCG和5 mM MgCl2混合，然后在冰上孵育10分钟以形成复合物。CsFAOMT1晶体在含有25 mM cacodylate钠，pH 6.5，30%（v/v）PEG8000和200 mM (NH4)2SO4的缓冲液中获得。CsFAOMT2晶体在含有100 mM柠檬酸钠，pH 5.5和1.5 M (NH4)2SO4的缓冲液中获得。在快速冷冻于液氮之前，晶体在含有10–25%（v/v）甘油的晶体生长缓冲液中短暂浸泡。数据在上海同步辐射装置上的BL19U1和BL17U1光束线上收集，并通过HKL200036处理。结构通过使用PFOMT结构（PDB代码：3C3Y）作为搜索模型的分子置换解决。在COOT37和Phenix38中进行迭代模型构建和精炼。数据收集和精炼统计在补充表3中总结。

蛋白质结构同源建模和分子对接

CsFAOMT1-L50M和CsFAOMT1-Y184R突变体的蛋白质结构同源建模以及随后将SAM和EGCG对接到结构中的分子对接使用Glide软件（Schrodinger–Maestro版本11.9）进行。在对接之前，对所有结构进行预处理，包括优化氢键网络、去除水分子和能量最小化。每个蛋白质结构中生成四个EGCG对接构象，选择与体外酶促实验结果一致的构象作为研究模型。