酰基转移酶综述-21年-地表最强系列-文献精读-3

Catalytic function, mechanism, and application of plant acyltransferases

植物酰基转移酶的催化功能、机制和应用

一篇关于植物酰基转移酶的综述，地表最强，总结的最全面的版本之一，各位看官有推荐请留言评论区~

Catalytic function, mechanism, and application of plant acyltransferases

植物酰基转移酶的催化功能、机制和应用

酰基转移酶（ATs）是重要的修饰酶，对自然产物的多样性起到贡献作用。它们催化酰基基团向骨架的转移，提高了天然化合物的脂溶性、稳定性和药理活性。近年来，已从植物中分离出许多ATs。在本综述中，我们总结了1997年7月至2020年10月期间已经进行生化特性描述的141种ATs，包括它们的功能、异源表达系统和催化机制。对它们的催化性能和应用潜力进行了进一步讨论。

关键词：BAHD-AT、催化应用、天然产物、植物酰基转移酶、SCPL-AT

引言

酰化是生物体中常见的化学反应[Citation1，Citation2]。它改变了天然产物的物理化学性质和药理活性。例如，酰化的花色苷类化合物在耐受热、光和pH变化方面比非酰化的花色苷类化合物表现出更高的稳定性[Citation3]。多酰化的脂多糖可以轻易引发宿主哺乳动物细胞的先天免疫反应，而酰化较少的脂多糖则不能[Citation4]。酰化还提高了黄酮类化合物的生物利用度和抗氧化活性[Citation5]，改变了胃泌素的代谢[Citation6]，并减少了氨基甲酸酯的急性毒性[Citation7]。在工业上，通常通过化学合成来实现酰化。像弗里德尔-克拉夫酰化这样的反应具有较差的区域选择性和毒性[Citation8]。另一方面，利用酰基转移酶（ATs）进行生物合成提供了一种高度特异性、无毒的途径。

酰基转移酶在植物、动物和微生物中普遍存在，作为修饰酶，将酰基从酰基供体转移到受体上[Citation2，Citation9]。植物中的ATs可分为两个家族，BAHD-AT（以首次鉴定的四种酶命名）和丝氨酸羧肽酶样酰基转移酶（SCPL-AT），分别使用酰基辅酶A硫醚和1-O-β-葡萄糖酯作为酰基供体[Citation2]。它们的产物在植物生长和发育中起着重要作用。例如，酰化的酚酸可以保护植物免受生物和非生物胁迫，番茄中的酰化糖可以表现出抗昆虫的效果，而酰化脂质是细胞膜的主要组成部分[Citation2，Citation10，Citation11]。

先前的综述主要集中在植物中BAHD-AT、SCPL-AT或与脂质相关的AT的体内和体外功能[Citation2，Citation12–14]。酶促酰化使用微生物水解酶（脂肪酶和蛋白酶）或AT的综述也已发表[Citation15–18]。为了将植物ATs作为生物催化剂使用，需要总结它们的催化性能和应用。在本综述中，我们总结了1997年7月至2020年10月期间从148篇文章中概述了141种经过生化特性描述的植物ATs，包括它们的体外功能、异源表达系统、催化机制以及催化应用。本综述将为生物合成和生物催化研究人员提供有价值的植物ATs信息。

植物中的酰化天然产物

酰化化合物根据它们的O-、N-、S-和C-酰键进行分类。携带O-和N-酰键的小分子广泛分布于植物中。它们的骨架包括黄酮类、生物碱、萜类、类固醇等次生代谢产物以及糖类、胺类和长链脂肪酸等主要代谢产物。图1展示了代表性的酰化天然产物。它们的生物活性已经得到了深入研究。例如，紫杉醇（taxol®）是一种O-和N-苯甲酰二萜，是一种抗卵巢、乳腺和非小细胞肺癌药物[Citation19，Citation20]。Montbretin A是一种咖啡酰-黄酮类糖苷，是一种高特异性的α-淀粉酶抑制剂和有前景的抗糖尿病药物[Citation21]。迷迭香酸和绿原酸是植物中广泛分布的抗氧化剂[Citation22，Citation23]。Avenacin A-1和avenanthramide B分别是燕麦中的抗微生物和抗真菌剂[Citation24，Citation25]。携带O-酰化甾体骨架的Caudatin 3-O-β-d-cymaropyranosyl-(1→4)-β-d-cymaropyranoside对人类结肠癌细胞HCT-116具有选择性细胞毒性[Citation26]。酰化化合物还在植物生物合成中作为生物合成前体物质。例如，盐酸舒尼曲林醇-7-O-乙酸酯是吗啡的中间体[Citation27]，而维诺啶是艾马林（Gilurytmal®）的前体，是一种抗心律失常单萜类吲哚生物碱[Citation28]。作为修饰步骤，酰化影响了植物细胞内次生代谢产物的运输和储存[Citation2]。例如，马来酰化促进了通过MATE型转运蛋白将黄酮类化合物进入液泡[Citation29]。由于SCPL-AT的液泡定位，相应的酰化产物积累在液泡中[Citation24]。

图1. 具有不同骨架的植物源酰化化合物。如果已经鉴定，催化形成这些化合物的酰基转移酶则在酰基旁边标示。

植物中的酰基转移酶

BAHD-AT

BAHD-AT以首次进行生化特性描述的四种酶命名，分别是苄醇O-乙酰转移酶、花色苷O-羟基肉桂酰转移酶、蒽氨酸N-羟基肉桂酰/苯甲酰转移酶和脱乙酰长春碱 4-O-乙酰转移酶[Citation2]。本综述总结了129种BAHD-AT，在此过程中利用各种酰基辅酶A（酰基-CoA）硫醚作为供体（见图2）[Citation10，Citation19，Citation23–25，Citation27–120]。这些酶大多数是O-乙酰转移酶（O-ATs），少数是N-乙酰转移酶。根据它们的受体，O-ATs进一步分类为：黄酮类、奎宁/烯丙酸、萜类、生物碱、醇类、脂质和蔗糖。

图2. BAHD-ATs和SCPL-ATs通用酰基供体的结构。BAHD-AT：苄醇O-乙酰转移酶、花色苷O-羟基肉桂酰转移酶、蒽氨酸N-羟基肉桂酰/苯甲酰转移酶和脱乙酰长春碱 4-O-乙酰转移酶；SCPL-AT：丝氨酸羧肽酶样酰基转移酶。

黄酮类酰基转移酶

黄酮类酰基转移酶通常从植物中报道。本综述考虑了共计26种黄酮类酰基转移酶[Citation29–45]。它们使用糖苷化的花色苷、异黄酮、黄烷酮、黄烷醇和黄酮作为酰基受体（见表1）。黄酮类糖苷的酰化通常发生在葡萄糖基的C6-OH上。特别地，Ss5MaT2催化了Salvia splendens中的C4-OH上的酰化，产生了丹参素，而Dm3MaT2催化了Dendranthema morifolium中的C3-OH，产生了花青素3-O-3″，6″-O-二马来酰基葡萄糖苷。有趣的是，对C3-OH或C4-OH的修饰被提出作为C6-OH酰化的连续步骤[Citation30，Citation31]。

大多数黄酮类酰基转移酶具有广泛的受体谱。例如，AtPMAT1利用了九种酰基受体，包括：黄豆苷、山奈酚3/7-O-葡萄糖苷和非黄酮类化合物（萘醇葡萄糖苷、苯基葡萄糖苷和硝基苯基葡萄糖苷）[Citation44]。At3AT1、At3AT2和GmMT7分别利用了超过七种黄酮类3/7-O-葡萄糖苷[Citation40,Citation42]。值得注意的是，一些酰化反应在体外显示出较高的转化率。例如，Dm3MAT1和Dm3MAT2以80%的转化率催化花青素3-O-葡萄糖苷的马来酰化[Citation31]。来自苜蓿草的MtMaT4以接近90%的转化率合成了芹菜素7-O-6″-O-马来酰基葡萄糖苷[Citation29]。

奎宁/烯丙酸酰基转移酶

共有25个酰基转移酶利用奎宁酸、烯丙酸或它们的衍生物（3-(3,4-二羟基苯基)乳酸和3-(4-羟基苯基)乳酸）作为酰基受体[Citation23,Citation46–62]（见表1）。在以前的综述中，它们也被称为HCT/HQTs[Citation2]。它们的供体主要是酚-CoA，如：羟基肉桂酰-CoA、对香豆酰-CoA和咖啡酰-CoA。酰基化通常发生在烯丙酸的C5-OH和奎宁酸的C3/5-OH上（一些研究中C3/C5位置的混淆）。这些酰基转移酶的产物是木质素生物合成的重要中间体[Citation14]。该组中的几种酰基转移酶在分析反应中显示出很高的催化效率。来自烟草的NtHCT以近100%的转化率催化对香豆酰化[Citation46]。来自美国雀稗的PvHCT1a以75%的转化率生成了对香豆酰烯丙酸[Citation50]。来自栓菜的CcsHQT2以55%的转化率生成了对香豆酰奎宁酸[Citation58]。

萜类酰基转移酶

总共报告了11种萜类酰基转移酶[Citation19,Citation63–71]。其中六种来自酸矾树，修改了紫杉醇的前体，包括：TcTAT、TcTBT、TcDBAT、TcBAPT和TcDBTNBT/TcTAX10（见表1）。TcTBT和TcDBTNBT分别以>90%的转化率催化2-去苄酰-7,13-二乙酰紫杉醇和N-去苄酰-(3′RS)-2′-去氧紫杉醇的苄酰化[Citation19,Citation63]。在随后的研究中，TcDBTNBT通过将16个芳酰-CoA和三个短碳链-CoA转移到紫杉醇前体上展示了广泛的酰基供体谱[Citation121]。来自菠菜的SOAP10催化对藻糖C4-OH的乙酰化，形成了皂苷yossoside V[Citation70]。来自拟南芥的AtSAT1将饱和脂肪酸酰基转移给环萜醇C3-OH[Citation68]。这些酶的研究主要集中在它们的天然酰基受体上。

生物碱酰基转移酶

生物碱酰基转移酶是植物酰基转移酶中最早被发现的一类[Citation27,Citation28,Citation72–74]。例如，1985年报道了自长春碱（长春碱前体）的17-O-乙酰转移酶[Citation122,Citation123]。1997年至2020年期间，从罂粟、白蚬、印度马钱、古柯碱和长春碱中报告了六种生物碱酰基转移酶。PsSALAT催化花青素生物碱salutaridinol转化为其7-O-乙酸酯，后者是吗啡的直接前体[Citation27]。RsVS催化乙酰化生成长春碱的前体vinorine，后者是阿姆特林（Gilurytmal®）的生物合成前体。在辅酶A的存在下，它还催化了反向反应[Citation28]。值得注意的是，吗啡和阿姆特林都不含酰基。这些酰化和去酰化产物在生物合成途径中短暂存在，用于器官靶向和通量调节，这也报道过在紫杉醇生物合成中[Citation27,Citation65]。生物碱酰基转移酶的酰基受体的多样性尚未完全研究。

醇酰基转移酶

总共有11种醇酰基转移酶利用含苯甲酰基的醇或短/中链醇作为酰基受体[Citation75–83]（见表1）。苯甲酰-CoA和乙酰-CoA是最常用的酰基供体。所有的脂肪醇酰基转移酶都展示了出色的受体多样性。特别地，FaSAAT催化了20多种醇的酰化[Citation76]。作为芳香醇酰基转移酶，鸡蛋花中的PhBPBT对13种受体展示了广泛的谱，包括：苄醇、3-羟基苄醇和2-苯乙醇[Citation81]。来自黑杨的PtSABT和PtBEBT催化生成了水杨基苯甲酸和苄基苯甲酸，转化率分别为75%和70%[Citation82]。醇酰基转移酶的产物大多是挥发性酯，是水果风味的主要来源[Citation75,Citation79]。

与脂类相关的酰基转移酶 酰基脂是植物细胞膜、种子油、角质质和次生质的主要组成部分[Citation12]。总共报道了20种酰基转移酶利用脂肪酸或脂肪醇作为受体[Citation84–96]，形成烷基-羟基肉桂酸酯（六种酶）或甘油脂（十二种酶）（见表1）。前一组酶使用芳酰-CoA供体，如：香豆酰-CoA和对香豆酰-CoA。来自拟南芥的AtASFT合成了十六烷基芹菜酸酯，转化率约为90%[Citation85]。后一组酶使用甘油衍生物作为受体，长链脂肪酸作为供体。它们进一步分为溶血磷脂酸酰基转移酶（LPATs）、二酰甘油酸酰基转移酶（DGATs）和甘油-3-磷酸酰基转移酶（GPATs），根据受体。例如，AtLPAT5将18:1-CoA转移到油酸-甘油-3-磷酸酯[Citation90]；当使用二酰甘油作为酰基受体时，ChDGAT1利用22:1-CoA[Citation94]；HaPLSB将16:0-CoA转移到甘油-3-磷酸[Citation91]。来自拟南芥的九种GPATs催化甘油-3-磷酸的酰基化，位置在sn-1或sn-2[Citation12]。它们没有包括在表1中，因为它们的功能尚未通过体外实验完全表征。

蔗糖酰基转移酶

从鼠尾草、番茄和番茄荚蒾中报道了十一种蔗糖酰基转移酶。在不同番茄品种中还发现了SlASAT2和SlASAT3的多个同源物[Citation10,Citation97–99]（见表1）。这些酶利用乙酰或C4–C8短链酰基修饰蔗糖，形成O-酰基糖，有助于抗虫性[Citation10]。大多数蔗糖酰基转移酶对短链酰基供体具有多样性，而SlAT2和SlASAT4对乙酰-CoA具有特异性[Citation10]。SlASAT1-4催化了蔗糖的C4、C3、C3′和C2-OH上的四步酰基化反应，表现出很高的位置特异性[Citation98]。PaxASAT1-4也催化了步骤性的酰基化反应，分别在C2、C4、C3和C6-OH上[Citation97]。其中，SlASAT2在催化3-甲基丁酰化酰基蔗糖中表现出了60%的较高转化率[Citation98]。

N-酰基转移酶 N-酰基转移酶（N-ATs）

将酰基附着到受体的N-原子上。总共总结了13种N-酰基转移酶[Citation24,Citation100–106]，其中酰基受体如：亚精胺、胍、色胺，供体如：对香豆酰-CoA、咖啡酰-CoA和硫代苯乙酰-CoA（见表1）。萜类酰基转移酶TcDBTNBT和TcTAX10也属于这种类型[Citation19,Citation67]。除了具有较高的位置特异性外，N-酰基转移酶还表现出相对较高的供体特异性。例如，来自拟南芥的AtSCT（编号为114，NP_180087）使用硫代芸香酰-CoA，而不是香豆酰-、香豆酰-和咖啡酰-CoA作为供体[Citation101]。AtSHT和HvACT对硫代芸香酰-CoA和对香豆酰-CoA具有供体偏好[Citation102,Citation103]。几种N-酰基转移酶显示了很高的催化效率。来自康乐丝石竹的DcHCBT以70%的转化率生成了N-苄酰-花青素酸[Citation100]。来自茄荚蒾的NaAT1和NaDH29催化了对羟基肉桂酰化胍和亚精胺，转化率分别为60%和90%[Citation105]。

丝氨酸羧肽酶样酰基转移酶

丝氨酸羧肽酶（SCP）样酰基转移酶被提出与肽酶S10家族的SCP同源[Citation2,Citation13]。自从从西红柿中发现的第一种SCPL-AT[Citation111]以来，已经对12种SCPL-AT进行了生化特性的研究[Citation24,Citation111–120]。它们利用1-O-β-葡萄糖酯作为酰基供体，包括：对芸香酰葡萄糖、香豆酰葡萄糖、咖啡酰葡萄糖、对香豆酰葡萄糖、N-甲基苯甲酰-O-葡萄糖等（见图2）。SCPL-AT在非植物宿主中的异源表达通常很困难，因为它们的翻译后修饰。许多研究采用了植物体系[Citation24,Citation114,Citation115,Citation118]或粗制蛋白质[Citation111,Citation116,Citation119,Citation120]，这些方法很难计算反应产率。最近，据报道AbLS在烟草叶中展示了约25%的转化率[Citation118]。SCPL-AT的液泡定位决定了产物的位置，这可能减少了酰化化合物对植物细胞的潜在毒性[Citation2,Citation13]。

系统发育分析

在以前的系统发育分析中，46个植物BAHD-AT根据它们的功能主要分为五个类群[Citation14]。在本研究中，使用129个生化特性已知的AT的氨基酸序列构建了系统发育树（见图3）。结果，植物AT主要根据它们的酰基受体进行分组，而不是供体或产物。表2总结了不同组的受体、供体、多样性、系统发育关系和体内功能。

黄酮类酰基转移酶（Flavonoid ATs）、奎宁/花生酸酰基转移酶（quinic/shikimic acid ATs）、蔗糖酰基转移酶（sucrose ATs）、醇类酰基转移酶（alcohol ATs）和SCPL-ATs被分组到不同的类群中，只有少数离群值。对于醇类酰基转移酶，芳香族或脂肪族酰受体不会影响分组。脂质酰基转移酶分为两组，分别使用脂肪酸和甘油衍生物作为受体。萜类酰基转移酶、生物碱酰基转移酶和N-酰基转移酶没有很好地分组，可能是由于受体结构有限和多样化。因此，AT的催化功能可以通过系统发育分析部分预测。

植物酰基转移酶的催化机制

BAHD-AT

BAHD-AT是大小为48-55 kDa的球形蛋白质。大多数BAHD-AT位于细胞质中，虽然其中少数位于细胞核中，但它们不含核定位信号或转运肽。迄今为止，已经表征了三种BAHD-AT蛋白质的结构。2005年首次获得了来自印度马缨丹的番松碱合酶RsVS的晶体结构。来自菊花的Dm3MaT3与马来酰辅酶A形成复合物的晶体结构也已获得。来自高粱的SbHCT是与对香豆酰基香草酸和辅酶A形成三元复合物结构的（见图4）。根据这些晶体，BAHD-AT蛋白质含有14-17个β-折叠和13-17个α-螺旋。它们分为两个大致相等大小的结构域，由一个交叉环连接。溶剂通道贯穿蛋白质分子。在反应过程中，供体与前端结合，而受体与背面结合。BAHD-AT蛋白质中最保守的结构特征是HXXXD和DFGWG。HXXXD暴露在溶剂通道中，并直接参与反应。催化的组氨酸残基可以从通道的两侧访问，而天冬氨酸残基则指向远离活性位点。DFGWG位于RsVS的β11和β12之间的一个转折处，靠近C-末端，远离活性位点。它在图4中说明了两个结构域的稳定。这两种结构特征对催化功能都是必要的。另一个特征序列YFGNC可能作为花青素酰基转移酶的标志。在人类N-AT中的催化三联序列CHD不是植物AT的特征。

图4. BAHD-AT的晶体结构和催化机制。 （A）RsVS的晶体结构。 （B）与马来酰辅酶A形成复合物的Dm3MaT3的晶体结构。 （C）与对香豆酰基香草酸和HS-CoA形成三元复合物结构的SbHCT的晶体结构。标记了I和II结构域。 （D）溶剂通道中与受体和供体在SbHCT活性位点上相互作用的氨基酸。 （E）BAHD-AT的催化机制。这些图根据参考资料重新绘制。

根据晶体结构，已经描述了SbHCT的催化机制（见图4(E)）。简而言之，酰基受体和供体通过溶剂通道首先结合到活性位点。然后，碱性组氨酸残基（H162）去质子化酰基受体的羟基或氨基团，形成氧负离子。接下来，氧负离子对酰基供体的羰基碳原子进行亲核进攻，形成四面体中间体。最后，中间体去质子化释放出一个CoA-SH分子，并形成新的酯或酰胺。在这个过程中，His-162在触发反应中起关键作用，而Thr-384和Trp-386通过氢键对稳定四面体过渡态至关重要。其他一些氨基酸也对维持蛋白质的构象起着重要作用。

SCPL-AT

SCPL-AT蛋白含有N-末端信号肽，将它们定位到液泡。据报道，保守的Ser-Asp-His（S-D-H）三联被认为有助于催化活性。虽然通过突变研究确认了其他保守的结构特征，但数量很少。SCPL-AT的晶体结构尚未报道，催化机制仍不清楚。基于SCP和SCPL-AT之间的相似性，提出SCPL-AT表现出与SCP类似的非顺序机制（双位移或乒乓机制）。通过对AtSCT（编号131，AAK52316）的动力学分析进行确认。然而，对AtSMT的分子建模显示了一种随机的顺序bi-bi机制。不同的机制表明SCPL-AT仍在经历进化变化。

植物BAHD-AT的定向突变

晶体结构与同源建模和序列分析相结合，提出了植物AT的催化机制。早期的突变研究证明了接近N-末端的SxL/I/VD和接近C-末端的DFGWG对RsVS的活性至关重要。SbHCT的T36A和H162A突变体显著降低了其活性。CaAT20的S405A突变体增加了结合腔的体积，促进了受体的进入。Dm3MaT1的七倍突变体（通过序列比较发现的关键氨基酸G35T/V37L/P38A/P51Q/N410Y/T412A/N418K）显示出与Dm3MaT2类似的功能。在两项分离的研究中，C-末端和N-末端分别有助于核定位和叶绿体转运。缺少来自C-末端的110个氨基酸残基（包括DFGWG基序）的截短型MtMaT1保留了其催化效率，但最适pH被修改。缺少来自N-末端的46个氨基酸残基的较短版本的AtDGAT3在体外更稳定。Fan等人比较了来自番茄、番茄野生近缘植物的潜在ASAT同源基因，发现了一系列关键氨基酸，改变了SlASAT2/3和SpASAT2/3的多样性。例如，SlASAT3的Y41C突变体获得了使用长链12:0-CoA作为受体的能力。

植物酰基转移酶的催化应用

化学酰化通常使用Lewis酸（AlCl3、FeCl3、BF3、ZnCl2和TiCl4）和Brønsted酸（HF、H2SO4和H3PO4）作为催化剂。这些反应通常受到有毒试剂和区域特异性差的困扰。相比之下，生物催化使用温和的条件，显示出相对较高的特异性。酶催化酰化已有三十多年的报道，主要集中在微生物酶上。

Candida antarctica和Pseudomonas cepacia的脂肪酶催化酰转移反应，用于修饰各种植物衍生化合物，包括：黄酮类化合物、香豆素和萜类化合物。它们显示出广泛的受体谱和优异的催化产率（高达91%的转化率）。然而，多羟基化合物的区域特异性较低。例如，PSL-C对槲皮素的乙酰化产生4'-、3'-和7-酰化产物，而CAL-B对异槲皮苷的酰化产生其3″, 6″-二乙酰基和2″, 3″, 6″-三乙酰基 [引文18]。此外，产品并不总是原生植物代谢产物。例如，试图合成6″-马来酰基人参皂苷Rb1结果得到了6⁗-马来酰基人参皂苷Rb1 [引文15]。因此，植物AT的催化应用需要进行讨论。

植物AT的整细胞催化

植物AT的整细胞催化反应有几种可用，其中大部分使用BAHD-AT。例如，在工程化的大肠杆菌BL21(DE3)菌株中，携带pC-NtHQT-Os4CL或pC-NtHST-Os4CL质粒，可以产生绿原酸（羟基肉桂酰奎宁酸）或羟基肉桂酰柳胺酸。这些质粒表达了来自N. tabacum的NtHQT/NtHST（表1中的NtHST是NtHCT）和来自O. sativa的Os4CL。通过添加羟基肉桂酸盐合成酰基供体。为了提高受体的浓度，工程化了大肠杆菌的柳胺酸代谢途径，并优化了反应条件，在8小时内得到了235 mg/L的对香豆酰柳胺酸盐，24小时内得到了450 mg/L的绿原酸。

通过共表达TpHCT2和上游基因实现了新生合成咖啡酸苹果酸酯。两个大肠杆菌BTAL菌株，一个产生咖啡酸（RgTAL和HpaBC），另一个催化两者结合（At4CL2和TpHCT2），以6:1的比例共培养72小时，获得了570.1 mg/L的咖啡酸苹果酸酯。

Appelhagen等人通过使用烟草细胞悬浮培养物，展示了乙酰化花色苷的有趣的规模化生产。通过共表达AmDel/AmRos1转录因子来激活花色苷生物合成途径，生产了90 mg/L的花青素3-O-芸香糖苷。连续表达Sl3AT导致了花青素3-O-(6″-O-香豆酰)和3-O-(6″-O-香草酰)芸香糖苷的产生。

为了生产酰基化脂质，对AtDGAT1进行了特性化和在酿酒酵母INVSc1中表达，使总脂肪酸增加了1.81倍。在另一项研究中，使用带有N-末端标签的BnaDGAT1过表达，在72小时内产生了453 mg/L的脂肪酸。

植物BAHD-AT也被用于扩大天然产物的多样性。使用携带At4CL和CbRAS的大肠杆菌BLRA1和苯乙酸类和香豆酸类类似物进行培养，产生了13种罗斯玛酸的非天然类似物。同时，S. cerevisiae pad1敲除菌株，共表达不同的BAHD-AT，在添加酰基受体和供体后产生了一系列化合物，包括：羟基苯乳酸/奎宁酸/甘油羟基肉桂酸酯；多胺羟基肉桂酸酰胺；单木质素/苹果酸/脂肪醇羟基肉桂酸酯；曲柳碱；和苯甲酸/咖啡酸醇酯。

最近，Srinivasan和Smolke报道了酵母中莨菪碱的新生合成，这涉及到SCPL-AT AbLS的成功表达。通过工程化N-末端融合实现了AbLS的功能表达。通过整合植物转运体NtJAT1和NtMATE2，解决了细胞间转运限制问题。通过过表达限制性酶和优化培养基，实现了高达3 mg/L的莨菪碱的积累。

BAHD-AT整细胞催化的主要瓶颈在于酰基受体和供体的供应。尽管它们可以通过构建工具模块/菌株来合成，但额外的努力可能导致更重的代谢负担，产量有限，并且/或产生副产物。例如，香豆酰辅酶A用作咖啡酰辅酶A的上游中间体，也是咖啡酰转移AT的供体。还检测到与两个或三个酰基供体结合的副产物。此外，从宿主菌株中纯化产品具有挑战性。例如，工程酵母产生了杉木醇松香酸酯，但仍然完全是胞内的。对于SCPL-AT，功能表达仍然是最大的挑战。

植物AT的酶促反应

植物AT的酶促反应通常在分析尺度（约100 μL）下进行，以检测产物或确定动力学参数。受体和供体都加入到混合物中。代表性的反应显示在图5中。酰化产物仅在少数研究中通过NMR进行纯化和表征。例如，从30 mL的反应系统中纯化了2-甲基丁酰基-蔗糖和2,4-二甲基丁酰基-蔗糖。

主要的酶催化反应瓶颈包括AT蛋白的低表达水平[Citation46]、低溶解度[Citation100,Citation113,Citation117]和不稳定性[Citation105]。我们已经在表1中总结了141个植物ATs的反应参数。一般来说，ATs是通过使用带有溶解标签的修饰载体（如pET28、pET15、pQE30和pDEST17等）在大肠杆菌BL21（DE3）中表达的。为了促进蛋白质的表达，例如BL21-CodonPlus（DE3）菌株会用于在细菌中罕见的密码子[Citation113,Citation117]。蛋白质通常使用Ni-NTA树脂或分子排阻色谱进行纯化[Citation107,Citation108]。在微生物表达系统中，SCPL-ATs和一些BAHD-ATs通常以不溶性包涵体的形式存在，这需要额外的步骤进行纯化和重折叠[Citation100,Citation113,Citation117]。

同时，反应体系需要进行优化。首先，植物ATs及其产物对pH值敏感。例如，CsHCT和SlHQT的最佳pH值分别为7.0和4.0[Citation59]。在pH≥7.0的条件下观察到了富马酸类三萜化合物上的乙酰基在C6-OH和C7-OH之间的转移[Citation144]。其次，金属离子对反应产率有贡献，尽管机制尚不清楚。例如，Mn2+和Mg2+/Na+增强了Gt5AT和Cm-AAT1的活性[Citation32,Citation75]。相反，Cu2+和Hg2+抑制了Dv3MAT和Ss5MaT1的活性[Citation33,Citation38]。第三，一些ATs对反应温度敏感，尽管大多数植物ATs偏好30°C。例如，AtDCF在50°C时表现出最高的活性[Citation88]。由于ATs及其产物的稳定性较差，反应时间通常较短（30分钟）。抗氧化剂如DTT或β-巯基乙醇被添加以防止氧化。

总结与展望

在过去的两十年中，已经对141个植物ATs进行了生化特性的表征。它们包括O-和N-ATs，但尚未从植物中发现C-和S-ATs的小分子。报道的ATs可以修饰各种植物代谢产物，包括：类黄酮类化合物、奎宁/芸香酸、萜类化合物、生物碱、醇类、脂质、蔗糖等。某些ATs的功能仍值得进一步研究。例如，Dm3MAT1和PhBPBT对几种受体和供体具有多样性，显示出良好的催化潜力。尽管观察到了高选择性，但大多数生物碱和萜类ATs的多样性仍然未知。对于未经表征的AT基因，可以使用系统发育分析来预测它们的酰基受体。

为了提出催化机制，已经获得了RsVS（生物碱AT）、Dm3MaT3（类黄酮AT）和SbHCT（芸香酸AT）的晶体结构用于BAHD-ATs。尽管如此，不同蛋白质结构之间的比较尚不可用，这阻碍了对其受体偏好的解释。对类黄酮葡糖苷C6-OH或蔗糖C2/3/4/6/3'-OH的选择性需要进一步解释。同时，SCPL-ATs（非顺序或随机顺序）的催化机制仍然存在争议。解释这些机制将有助于将ATs定向演变为生物催化剂。

尽管几种ATs在分析反应中显示出较高的转化率，但植物ATs在扩大规模反应中的应用仍然受到限制。与其他修饰酶如糖基转移酶[Citation145,Citation146]相比，ATs的低产率应该与蛋白质的理化性质或被酰化产物的催化功能受到抑制有关。改善蛋白质的表达和稳定性仍然需要相当大的努力。对于整细胞催化，研究为在工程大肠杆菌中产生绿原酸（450 mg/L）和咖啡酰苹果酸（570 mg/L）设定了良好的示范[Citation133,Citation134]。酰基受体/供体的供应和快速的产品纯化对于工业应用至关重要。SCPL-AT的液泡定位的功能表达也需要额外的努力。在酵母中成功表达AbLS为人们提供了宝贵的参考[Citation141]。与微生物相比，烟草细胞培养提供了一种可定制且可行的替代平台[Citation135]。最后，共表达转录因子，如MYB、bHLH、WDR和WRI1，也可以上调ATs的表达，并在一些报道中有助于产量[Citation147,Citation148]。