单细胞测序技术是在单个细胞水平上，对基因组、转录组和表观基因组水平进行分析测序技术。bulk RNA-seq获得的是组织或器官等大量细胞中表达信号的均值，无法获取细胞之间的差异信息（即丢失了细胞的异质性）， 而单细胞测序技术可以很好的弥补bulk RNA-seq这一不足，即获取混合样本中细胞的异质性信息。
文章 单细胞RNA测序（scRNA-seq）Seurat分析流程入门 中涉及Seurat对象的构建、访问和数据提取等操作，本文将对Seurat对象的结构进行深入解读。
1. 单细胞分析中Seurat对象的结构
Seurat R包，主要用于分析单细胞RNA测序数据。Seurat包实现了单细胞RNAseq数据分析的主要步骤,包括质控、归一化、可视化、聚类、差异表达等。Seurat对象用于存储单细胞RNA-seq元数据和分析结果，
Seurat 5.0官网： https://satijalab.org/seurat/
2. Seurat 包的主要功能
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从原始gene表达矩阵构建AnnotatedChip对象,或从已有格式如SingleCellExperiment对象进行转换；
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用于质控的功能,如过滤低质量细胞,检测高变基因等；
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用于数据标准化的方法,如缩放,归一化等；
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用于数据降维和可视化的工具,如PCA,tSNE,UMAP等；
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用于数据聚类的方法,如Louvain算法,K-means等；
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用于差异表达分析的功能；
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支持进行GO/KEGG富集分析,蛋白质相互作用网络分析等；
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提供丰富的绘图功能,如特征作图,等高线图,热图等；
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支持对象的导出与共享, 便于重复分析或与他人交流。
3. Seurat 对象包含的主要域(slots)
Seurat 对象（实际称为AnnotatedChip对象）包含多个域(slots), 存储不同类型的信息，主要关注前4个slots，理解其含义。
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- assays: 存储数据集的表达矩阵及相关信息
这里只有一个RNA域,对应RNA表达数据。其包含:
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counts:原始表达计数矩阵,行为基因,列为细胞。
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data: 与counts相同,用于兼容以前的seurat版本。 数据进行了VST变换后,存储在data域,而非scale_data域。
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scale.data: 标准化后的表达矩阵。
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key:表达矩阵的标识符,此处为”rna_“。
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assay.orig:原始表达矩阵,此处为空。
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var_features:变异基因信息。如果进行筛选，例如选定了2000个变异基因,存储在var_features域
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meta.features:包含每个特征的统计量,如平均值、方差、标准化方差等,用于过滤低变异特征。
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misc:杂项,此处为空。
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- meta_data: 存储细胞元数据,如细胞类型,count数等
meta_data域包含更丰富的信息,如percent.mito,聚类标签等，包含具体信息如下：
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orig.ident:样品的原始ID,此处全部为”SeuratProject”。
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nCount_RNA:每个细胞的UMI计数,在RNA表达矩阵中。
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nFeature_RNA:每个细胞检测到的特征数,在RNA表达矩阵中。
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percent.mito:每个细胞线粒体特征的百分比,用于过滤低质量细胞。
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RNA_snn_res.0.5:构建RNA_snn网络图时resolution为0.5时的聚类结果。
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seurat_clusters:Seurat的FindClusters命令产生的聚类结果,resolution同为0.5。
这个域汇总了样品和表达数据的基本信息,以及两种不同参数下的聚类结果。
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active.assay: 设置当前使用的表达矩阵, 这里是RNA
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active.ident: 细胞ID,对应列名
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graphs:网络图信息,用于存储PCA,tSNE等结果
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reductions:用于存储降维结果,如PCA,UMAP的模型对象
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images:存储绘图 Output,用于再现分析过程
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project.name:项目名称
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version:seurat对象的版本信息
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- commands:存储构建seurat对象使用的所有命令,以支持再现分析过程
每个命令都包含name、time.stamp 时间戳、assay.used、call.string和params等域,记录命令名称、运行时间、使用的表达矩阵、命令语句和参数等信息， 具体如下：
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ScaleData:标准化表达矩阵。
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NormalizeData:对表达矩阵进行归一化。
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FindVariableFeatures:找到高变异特征。
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RunPCA:进行PCA分析。
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RunTSNE:进行tSNE分析。
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RunUMAP:进行UMAP分析。
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JackStraw:进行置换检验。
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ScoreJackStraw:给置换检验结果打分。
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FindNeighbors:构建邻居网络图。
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FindClusters:进行聚类分析。
- tools:存储分析中使用的其他软件包版本信息
4. Seurat 对象基本操作
4.1 访问 Seurat 对象的域slot
Seurat 对象中assays用于存储表达矩阵， counts存储原始数据（稀疏矩阵），data存储Normalize()之后的数据，scale.data存储ScaleData()缩放后的数据，SCT存储标准化之后的数据， meta.data存储细胞注释信息（或称为临床信息）， active.assay存储默认的矩阵名, active.ident存储默认的细胞注释信息（或称为临床信息）。
library(Seurat)
# 读取10X PBMC数据
pbmc.data <- Read10X(data.dir = "./pmbc")
sobj <- CreateSeuratObject(counts = pbmc.data)
###### 使用@或$访问第1层域slot ######
# 获取原始表达矩阵第一层slot
counts <- sobj@assays
# 访问元数据
meta <- [email protected]
###### 使用@ + $访问第3层域slot ######
# 提取counts域,获得原始表达矩阵
counts <- sobj$RNA@counts
###### 使用[[ ]] 访问域, 允许域名包含特殊字符(如.),和$作用类似######
counts <- sobj[["nCount_RNA"]]
counts <- sobj[["RNA"]]
###### GetAssayData获取表达矩阵 ######
# 一个Seurat对象可存储多个表达矩阵
counts.matrix <- as.matrix(GetAssayData(object = sobj@assays$RNA, layer = "counts"))[1:10, 1:10]
slotNames():列出所有域的名称。
VariableFeatures():提取高变异特征。
4.2 数据提取和转换
提取数据并转换为data.frame, 可使用@ / $ / [[ ]]对Seurat 对象取值。
# 提取counts数据矩阵
expression_matrix <- sobj[["RNA"]]@counts
# 将矩阵转换为data.frame
expression_df <- as.data.frame(expression_matrix)
# 提取细胞元数据矩阵
expression_matrix <- [email protected]
4.3 FetchData()函数提取数据
FetchData()函数可提取meta.data和reductions数据框的数据， slot参数只能为 “data”, “scale.data”, “counts。
FetchData(object = sobj, vars = 'PC_1',slot = "counts")
FetchData(object = sobj, vars = 'nCount_RNA')
FetchData(object = sobj, vars = 'groups')
FetchData(object = sobj, vars = 'PPBP')
FetchData(object = sobj, vars = c("tSNE_1","tSNE_2"),slot = "counts")
FetchData(object = sobj, vars = c("tSNE_1","tSNE_2"),slot = "data")
FetchData(object = sobj, vars = c("tSNE_1","tSNE_2"),slot = "scale.data")
4.4 subset()函数提取数据
使用subset()根据meta.data中因素对Seurat对象进行子集的选择（或过滤）。
# 提取MT-开头的基因的meta.data至percent.mito列中
sobj <- PercentageFeatureSet(sobj, pattern = "^MT-", col.name = "percent.mito")
# 提取每个细胞中检测特征数 大于200且小于2500，线粒体含量小于5%的数据
sobj <- subset(sobj, subset = nFeature_RNA > 200 & nFeature_RNA < 2500 & percent.mito < 5)
4.5 为Seurat对象添加域
add.data <- data.frame(
gene = c("gene1", "gene2", "gene3"),
value = c(1.2, 3.4, 5.6))
# 将my_data添加到Seurat对象的misc slot中
sobj@misc$add_data <- add.data
# 查看misc slot中的my_data
sobj@misc$add_data
## gene value
## 1 gene1 1.2
## 2 gene2 3.4
## 3 gene3 5.6