1、原核甲基化
- 原核生物中的DNA甲基化
- 原核生物甲基化为什么基于三代测序？
第三代DNA测序为原核细菌的甲基化和表观遗传的研究开辟了一条新的途径，能够在基因组的水平上获取整个表观遗传的序列信息，绘制全基因组甲基化组。
- 细菌中DNA甲基化研究意义
Matthew J. Blow等人通过对200多种不同的细菌和其他原核生物，例如古细菌等研究发现，超过90％的原核生物中都存在DNA甲基化，并且有600多个甲基转移酶，表明存在大量的甲基化修饰多样性。
研究还观察到了许多其他的DNA甲基化模式（甚至包含没有限制性内切系统）。这表明DNA甲基化系统在原核生物中参与基因组调控，并在原核生物的生理生化中有着至关重要的作用，如调节毒力、抗生素耐药性，及适应氧化、缺氧、营养匮乏、酸性 pH 等环境。
- 细菌全基因组甲基化纳米孔测序(ONT)
- 技术路线
- 技术优势
- 长读长：平均读长＞10Kbp，最长可达2M左右，直接跨越重复序列、高度多态性区域等特殊区域；
- 直接测序：无需PCR扩增，可直接保留并检测DNA甲基化修饰；
- 全基因组覆盖：可同时检测全基因组范围单碱基的5mC与6mA修饰位点，并给出单碱基的甲基化水平；
- 性价比高：ONT测序成本相对于二代NGS测序技术大幅降低。
2、原核转录组（mRNA+sRNA）
原核转录组测序可以从基因表达量、基因结构和sRNA调控功能三维度揭示不同生物性状的分子调控机制。如通过计算各组间的差异基因并对差异基因进行富集分析，获得对生物性状影响较大的通路信息；通过预测基因的反义转录本，丰富基因组注释内容；研究sRNA对mRNA的相互作用，从分子调控角度解释生物性状之间的差异。
- 细菌中转录组研究意义
转录技术在原核生物转录组研究上的突破，已经显示出其在揭示原核生物生命过程的分子机制上独特的优势。对原核生物的转录组研究开始于致病菌，但不止步于致病菌。近年来，原核转录组已成为一种普遍的研究方法，而通过转录组学分析环境胁迫、抗菌药物、生防细菌处理下的原核生物更早已成为研究热点。
- 基因表达量分析
- 差异基因鉴定
- 非编码RNA鉴定等
- 原核转录组测序(mRNA+sRNA)
易基因专利技术：针对检测原核菌个性化设计rRNA去除探针，利用高通量技术对原核细胞所产生的所有mRNA和sRNA（非编码RNA）进行测序。系统全面解析特定细胞所产生的mRNA和sRNA对生物性状的影响。
- 技术路线
- 技术优势
- 针对原核生物设计去除rRNA专属探针，rRNA去除效果好。
- 同时分析sRNA与mRNA的互作关系，更加全面解读表达互作网络。
易基因原核转录组“rRNA捕获探针及其应用“方法获发明专利授权
3、原核甲基化+转录组组学关联分析
原核甲基化+转录组联合分析可同时实现从“因”和“果”两个层面研究生物学问题，串联证据，并对其相关性进行验证，从不同的角度合力探索和解释生物学问题。
判断组学之间是否可以进行关联：是否有关联的生物学理论基础？
如：
• 启动子区甲基化会抑制基因的表达；
• 基因主体甲基化与基因表达正相关等。
因果关系的论证一般需要严密的分子实验。
研究案例
- 原核甲基化研究案例
痤疮表皮杆菌噬菌体表观遗传印迹的工程选择性研究
文章期刊：PLoS Pathog 202203
影响因子：IF 6.7
技术平台：原核甲基化测序分析
实验样本：痤疮表皮杆菌(C. acnes)
研究背景：
痤疮杆菌（C.acnes）是一种革兰氏阳性细菌，是人类皮肤微生物组成员。尽管是最丰富的皮肤共生体，但某些成员与常见的炎症性疾病（如痤疮）有关。各种C.acnes分支的完整基因组序列可以鉴定推定的甲基转移酶，其中一些可能属于保护入侵DNA宿主的限制性修饰（R-M）系统。然而，关于这些系统是否在不同的C.acnes菌株中起作用，目前知之甚少。
研究结果：
在菌株KPA171202中确定的DNA共有序列上检测到6mA修饰，且该R-M系统的重组表达证实了其甲基化活性，而R-M敲除突变体验证了该菌株甲基化特性的缺失。此外还研究了C. acnes噬菌体（PAD20）杀死各种C. acnes菌株的潜力，并将其特异性的增加与甲基化敏感株获得的噬菌体DNA甲基化联系起来。研究证明R-M缺失菌株中繁殖的噬菌体选择性地杀死R-M缺失痤疮敏感分支，而益生菌保持对噬菌体感染的抗性。
图1：C.acnes KPA171202（SLST H2）具有在AGCAGY序列甲基化motif的功能性R-M系统。
图2：C.acnes KPA171202的R-M系统IIIB影响PAD20噬菌体感染性状并保护细菌免受裂解。
- 原核转录组研究案例
项目文章｜原核转录组测序分析揭示微藻对镉胁迫的短期和长期响应分子机制
文章期刊：CHEMOSPHERE 202205
影响因子：IF 8.8
技术平台：原核转录组测序分析、WGCNA分析
实验样本：微藻
研究背景：
由于镉(Cd)的生物蓄积性和生物不可降解性，即使在低浓度下，镉也会对生态系统构成严重威胁。微藻是一种很有前途的重金属去除剂和有效的工业污水净化剂。然而，关于镉胁迫下微藻的短期和长期响应分子机制的详细报道很少。本研究对微藻在EC50值（concentration for 50% of maximal effect,EC50）下的吸附行为（生长曲线、Cd去除率、SEM、FTIR和胞外多糖(EPS)动态变化）、细胞毒性（光合色素、MDA、GSH、H2O2、O2-）和胁迫响应机制进行探讨。
研究结果：
本研究通过原核生物的转录组RNA-seq在对照和15 min、48 h、72 h和96 h处理组中检测到1413个差异表达基因（DEGs）。这些基因被证明是镉敏感DEGs，且与核糖体、氮代谢、硫转运蛋白和光合作用相关。WGCNA（加权基因共表达网络分析）揭示了两种主要的基因表达模式：短期响应（381个基因）和长期响应（364个基因）。DEGs富集分析表明，参与氮（N）代谢、硫转运蛋白和氨酰-tRNA生物合成的基因表达显著上调，为初期合成金属螯合蛋白、抗性金属蛋白和转运蛋白（ABC转运蛋白）的重要组分（半胱氨酸）提供了原料，是一种短期响应机制。前15分钟的Cd吸附主要依赖于膜转运蛋白和预先蓄积的EPS。同时，上调的谷胱甘肽S-转移酶（GSTs）家族蛋白在外源性镉的初始抗性中发挥作用。受损的光合系统在后期得到修复，糖酵解和糖异生表达上调，满足生理代谢活动的能量和物质。本研究首次提供了微藻响应镉胁迫的短期和长期分子机制。同时，本研究中鉴定的关键基因可以作为藻类基因工程的潜在靶点。
参考文献：
Knödlseder N, et al. Engineering selectivity of Cutibacterium acnes phages by epigenetic imprinting. PLoS Pathog. 2022 Mar;18(3):e1010420.
Tian Q, et al. Longitudinal physiological and transcriptomic analyses reveal the short term and long term response of Synechocystis sp. PCC6803 to cadmium stress. Chemosphere. 2022 Sep;303(Pt 1):134727.
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标签：原核,研究,测序,基因,甲基化,转录 From： https://www.cnblogs.com/E-GENE/p/17769214.html