【卡梅德生物】如何制备纳米抗体？

纳米抗体的制备通常涉及到从动物源（如骆驼、驼鹿）提取RNA或cDNA，然后通过分子生物学技术将其克隆并表达。以下是一般的纳米抗体制备步骤：

1.提取RNA或cDNA：

-动物源：选择产生纳米抗体的动物，如骆驼、驼鹿等。从这些动物的B细胞中提取RNA或cDNA。

2.构建纳米抗体基因：

-PCR扩增：使用适当的引物，对VHH基因进行PCR扩增。

-基因克隆：将扩增得到的VHH基因克隆到表达载体中。表达载体通常包括启动子、选择标记基因、VHH基因等。

3.表达系统的选择：

-原核表达系统：选择大肠杆菌等原核表达系统，通过转化将表达载体导入细菌中，使其表达VHH蛋白。

-哺乳动物细胞表达系统：选择CHO细胞、HEK293细胞等哺乳动物细胞，通过转染将表达载体导入细胞中，以实现纳米抗体的表达。

4.表达与优化：

-转染/转化：将构建好的表达载体导入表达系统中，通过细胞转染（哺乳动物细胞）或者细菌转化（大肠杆菌）等方式引入表达载体。

-优化条件：对表达条件进行优化，包括温度、培养基成分、感染/诱导时间等，以提高VHH的表达水平。

5.细胞培养与收获：

-细胞培养：在适当的培养条件下扩大表达系统中的细胞。

-收获：在表达过程结束后，收集细胞，可以通过离心或其他方法获得细胞上清液。

6.纯化：

-亲和层析：利用VHH与其靶标的特异结合，选择使用亲和层析柱，如蛋白A/G层析柱。

-透析：将VHH在亲和层析后进行透析，以去除悬浮在缓冲液中的杂质。

-离心：利用超速离心等方法去除大颗粒或细胞碎片等。

7.评估与储存：

-纯度分析：使用SDS-PAGE、Westernblot等方法对VHH的纯度进行分析。

-功能验证：确保VHH保持对目标抗原的高亲和性和特异性。

-储存：将纯化好的VHH冻存，以确保其长期稳定性。

以上步骤是一般的纳米抗体制备过程，具体的实验条件和方法可能会因实验室的具体需求而有所调整。