宏基因组测序流程及其分析步骤

1. 测序样本信息：完成了70个根际土壤样本的宏基因组测序。

2. 数据预处理：

   • 使用KneadData工具进行质控和去宿主处理。
   • 利用Trimmomatic去除接头序列并进行质量过滤。
   • 使用Bowtie2构建宿主库和进行去宿主处理。

3. 从头组装：采用MEGAHIT工具对原始测序数据进行从头组装，生成contigs。

4. 基因预测与处理：

   • 使用Prodigal进行基因预测，生成DNA和蛋白质序列，并对其长度进行过滤。
   • 利用CD-HIT对DNA序列进行聚类，生成非冗余序列，并通过Perl脚本筛选相应的蛋白质序列。

5. 基因定量：构建Salmon索引并对原始测序数据进行基因定量分析。

6. 物种注释：

   • 使用Kraken2进行多层次的物种注释，包括读长、重叠群、基因和宏基因组组装基因组的注释。
   • 利用Bracken（Kraken 2的伴生程序）计算物种的丰度。

7. 功能注释：

   • 使用HUMAnN工具套件进行多层次的功能注释，包括通路覆盖和基因家族注释。
   • 利用Bowtie2和MetaPhlAn3分别进行库构建和微生物群落分析。
   • 对基因家族进行重新分组和分类，并标准化丰度数据。

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流程描述：

1. 开始 -> 测序70个根际土壤样本的宏基因组。

2. 数据预处理：

   • 输入：原始测序数据。
   • 使用KneadData进行质控和去宿主。
     • 子步骤：
       • Trimmomatic：去除接头序列，质量过滤。
       • Bowtie2：构建宿主库，去宿主处理。
   • 输出：预处理后的数据。

3. 从头组装：

   • 输入：预处理后的数据。
   • 工具：MEGAHIT。
   • 输出：contigs。

4. 基因预测与处理：

   • 输入：contigs。
   • 子步骤：
     • Prodigal：进行基因预测，输出DNA和蛋白质序列。
     • CD-HIT：对DNA进行聚类，输出非冗余序列。
     • Perl脚本：筛选相应蛋白质序列。
   • 输出：预测的基因和蛋白质序列。

5. 基因定量：

   • 输入：原始测序数据、预测的基因序列。
   • 工具：Salmon。
   • 输出：基因的定量数据。

6. 物种注释：

   • 输入：原始测序数据、contigs。
   • 子步骤：
     • Kraken2：进行多层次的物种注释。
     • Bracken：计算物种的丰度。
   • 输出：物种的注释和丰度数据。

7. 功能注释：

   • 输入：原始测序数据、预测的基因和蛋白质序列。
   • 子步骤：
     • HUMAnN：进行多层次的功能注释。
     • Bowtie2 & MetaPhlAn3：库构建，微生物群落分析。
   • 输出：功能注释、通路覆盖和基因家族注释。

8. 结束。