易基因：表观多组学揭示SETDB1调控神经前体细胞的短散在核元件和染色质环构象

大家好，这里是专注表观组学十余年，领跑多组学科研服务的易基因。

转座元件（TE）在神经发育期间的维持基因组结构中起着关键作用。短散在核元件（Short Interspersed Nuclear Elements，SINE） 是转座元件的主要亚型，已知含有 CCCTC 结合因子 （CTCF） 的结合位点，并在调控染色质构象中具有重要作用。然而SINEs在发育中的大脑的活性调控机制尚不清楚。

2024年7月3日，复旦大学脑科学研究院江燕课题组与基础医学院刘赟课题组博士后蒙伟达合作共同通讯，利用广泛的表观基因组分析，包括ATAC-seq、抗H3K9me3 ChIP-seq、WGBS、抗CTCF ChIP-seq、原位Hi-C以及RNA-seq分析，揭示了小鼠神经前体细胞（NPCs）中组蛋白甲基转移酶SETDB1调控SINEs活性和染色质环构象的表观遗传分子机制，及其在NPCs增殖中的作用。相关研究成果以“SETDB1 regulates short interspersed nuclear elements and chromatin loop organization in mouse neural precursor cells”为题发表在《基因组生物学》（Genome Biology）杂志上。

标题：SETDB1 regulates short interspersed nuclear elements and chromatin loop organization in mouse neural precursor cells

时间：2024.07.03

期刊：Genome Biology

影响因子：IF 10.1 / 1区

实验方法：ChIP-seq、WGBS、ATAC-seq、Hi-C、RNA-seq

研究方法：

使用ATAC-seq、ChIP-seq、全基因组亚硫酸盐测序(WGBS)、原位Hi-C和RNA-seq等技术，在小鼠神经前体细胞中进行了全基因组范围的表观遗传分析。

研究结果：

本研究通过对小鼠神经前体细胞（NPCs）进行全面的全基因组表观遗传分析，研究结果表明，SETDB1介导的H3K9me3与DNA甲基化发挥协同作用，抑制了神经前体细胞中特定类群SINEs位点的染色质可及性。Setdb1基因敲除增加了CTCF对这些SINE元件的可及性，CTCF与这些位点结合介导染色质环的重分布。而新形成的染色质环参与调控基因表达，包括调控有丝分裂功能通路中富集的基因失调，从而影响神经前体细胞的细胞周期。此外，Setdb1基因敲除在体内和体外导致胚胎大脑中细胞增殖破坏。研究揭示了小鼠神经前体细胞中SINEs的表观遗传调控，表明其在维持神经发育期间的染色质构象和细胞增殖中的作用。总之，本研究揭示了发育脑中SETDB1调控SINEs元件和三维染色质构象的分子机制，并为转座元件参与神经发育提供新的理论依据。

研究亮点：

• 本研究首次揭示SETDB1通过H3K9me3和DNA甲基化协同发挥对SINEs的调控作用，为理解神经发育中的表观遗传机制提供了新的视角。
• 研究揭示了SINEs在神经发育中的新功能，尤其是在细胞增殖调控中的作用。
• 研究结果强调了表观遗传修饰在神经发育中的重要性，并为未来的神经发育和相关疾病研究提供了潜在的靶点。
• 整体来看，本研究深入探讨了SETDB1在神经发育中的表观遗传调控作用，特别是在染色质构象和基因表达调控中的功能，为理解大脑发育和相关疾病的分子机制提供了重要信息。

结果图形：

（1）小鼠神经前体细胞敲除Setdb1后，SINE_B2元件的染色质可及性增加

为了研究SETDB1对发育中大脑TE的调控作用，研究人员在小鼠胚胎第15.5天（E15.5）从野生型（WT）和SETDB1敲除（KO）的大脑中分离出神经节隆起（ganglionic eminences，GE），并进行神经球培养。收获纯化的NPC进行各种表观基因组分析，包括全基因组染色质可及性（ATAC-seq）、H3K9me3和CTCF占位情况（ChIP-seq）、DNA甲基化（WGBS）、3D基因组组织（原位Hi-C）和基因转录（RNA-seq）的分析（图1）。

图1：小鼠神经前体细胞中敲除Setdb1基因后，SINE_B2元件染色质可及性增加的实验过程和结果

通过以上表观多组学技术分析揭示了Setdb1基因敲除对小鼠神经前体细胞中SINE_B2元件染色质可及性的作用，包括转座元件活性和特定基因组区域开放性变化。分析结果表明特定SINE_B2元件类群的染色质可及性受 NPC 中 SETDB1调控。

（2）NPC Setdb1敲除后SINE_B2上H3K9me3减少

SETDB1是最重要的组蛋白甲基转移酶之一，对H3K9me3具有特异性。因此作者研究了SETDB1是否通过H3K9me3沉积抑制NPC中SINE_B2元件的染色质可及性。为了探索这一点，作者在WT和KO的NPC中进行了抗H3K9me3 ChIP-seq。随后分析了ATAC-seq和H3K9me3ChIP-seq数据集的差异peaks之间的信号相关性。

图2：NPCs中敲除Setdb1基因后，SINE_B2元件上H3K9me3水平降低的实验分析和结果

1. 野生型(WT)和敲除型(KO)神经前体细胞中H3K9me3 ChIP-seq的相关性热图。
2. 火山图显示了H3K9me3 ChIP-seq的差异分析。KO/WT，N = 3，FDR < 0.05，|Log2FoldChange| ≥ 0.585。红色表示上调，蓝色表示下调，灰色表示无显著变化(Non_sig)。
3. 在小鼠基因组上下调H3K9me3峰(K9_down)的富集分析。
4. K9_down在“TE_class”(左)，“SINE_family”(中)和“B2_subtype”(右)上的富集。虚线表示P-adj = 0.05。Fisher精确检验，B-H校正，**P < 0.01，***P < 0.001，P < 0.0001。
5. 在与ATAC_up重叠的B2位点(ATAC_up_B2)上的H3K9me3信号剖面和热图。
6. 在与K9_down重叠的B2位点(K9_down_B2)上的ATAC-seq信号剖面和热图。
7. IGV地图轨迹显示了Chr5上WT和KO的H3K9me3(K9)信号。垂直条表示K9_down和ATAC_up_B2的位置。黄色阴影表示放大的区域i和ii。

（3）Setdb1敲除后NPCs DNA甲基化的变化

先前研究表明了SETDB1介导的H3K9me3与DNA甲基化在神经元基因簇上的互作。为此，本研究在WT（野生型）和KO（敲除型）的神经前体细胞(NPCs)中进行WGBS（全基因组亚硫酸盐测序）以检测DNA甲基化。随后，分析评估DMR和ATAC-seq峰之间的交集。

图3：NPCs中敲除Setdb1基因后DNA甲基化变化。

1. MA图显示了来自WT（野生型）和KO（敲除型）NPCs的WGBS的差异甲基化区域（DMRs）。N = 2, |MeanDiff| ≥ 0.1。红色代表高甲基化（Hyper）。蓝色代表低甲基化（Hypo）。灰色代表无显著变化（Non_sig）。AvgMeth代表平均DNA甲基化水平。MeanDiff代表KO和WT之间的平均DNA甲基化差异。
2. TEs（转座元件）、SINEs和非TE区域的DMR和全基因组MeanDiff和AvgMeth。
3. 小鼠基因组上显著低甲基化DMRs（DMR_hypo）的富集情况。
4. DMR_hypo在“TE_class”（左）、“SINE_family”（中）和“B2_subtype”（右）上的富集情况。虚线表示P-adj = 0.05。Fisher精确检验，B-H校正，P < 0.0001。
5. 重叠DMRs和ATAC-seq峰（DMR & ATAC）的MeanDiff和ATAC-seq信号的Log2FoldChange（ATAC_log2FC）。sig_B2/all表示B2/所有DMR & ATAC峰上显著DMR & ATAC峰的数量。紫色代表sig_B2。灰色代表non-sig_B2。注意sig_B2在第四象限富集。Fisher精确检验，P < 0.0001。
6. (E)中第四象限sig_B2的H3K9me3信号剖面和热图。
7. IGV图轨迹展示了WT和KO在重叠DMR_hypo、K9_down和ATAC_up_B2位点上的DNA甲基化水平。

（4）NPC Setdb1敲除后CTCF对SINE_B2结合增加

已知SINE_B2元件具有携带CTCF结合位点（CBS）的潜力。目前的研究中，B2元件中 CTCF motif的富集具有 ATAC_up、K9_down 和 DMR_hypo 事件。因此，研究人员进行了抗CTCF ChIP-seq来表征WT和KO NPC中的CTCF结合图谱。随后对CTCF ChIP-seq、ATAC-seq 和 WGBS 数据集进行综合分析。

图4：NPCs中Setdb1基因敲除后，CTCF结合在SINE_B2元件上的增加情况。

1. 火山图展示了差异CTCF ChIP-seq峰。KO/WT，N = 3，FDR < 0.05，|Log2FoldChange| ≥ 0.585。红色代表上调，蓝色代表下调，灰色代表无显著变化(Non_sig)。
2. 在小鼠基因组上上调的CTCF峰(CTCF_up)的富集情况。
3. 重叠(CTCF_up_B2, 左)和不重叠B2元件(CTCF_up_NonB2, 右)的CTCF_up峰的前10个富集的Homer已知motif。

D-G. CTCF ChIP-seq (D)、ATAC-seq (E)、H3K9me3 ChIP-seq (F)和WGBS (G)在CTCF_up_B2上的信号剖面和热图。

H. IGV图轨迹展示了(D-G)中CTCF_up_B2上的代表性信号。

1. 密度图显示了所有CTCF峰(All, 紫色)、CTCF_up (Up, 蓝色)和CTCF_up_B2 (Up_B2, 红色)到转录起始位点(TSS)的距离。灰色阴影，启动子区域(TSS ± 3 Kb)。

（5）Setdb1 敲除后 CTCF 结合增加的SINE_B2染色质环重分布

近年来，CTCF因其在维持三维基因组结构中的中心作用而得到了广泛研究，主要通过介导染色质折叠实现。本研究分析了全基因组CTCF结合增加对KO NPCs（敲除型神经前体细胞）中染色质构象的作用。

图5：在Setdb1基因敲除后，CTCF结合增加导致SINE_B2上的染色质环重新分布

（6）Setdb1 敲除后与环重分布相关的差异基因表达

图6：Setdb1敲除后与环重分布相关的差异基因表达。

图7：Setdb1敲除后影响NPC增殖。

研究小结：

本研究数据结果揭示了小鼠神经前体细胞（NPCs）中特定SINE_B2元件类群的表观遗传特征。这些SINE_B2元件在SETDB1介导的H3K9me3调控下，与DNA甲基化协同发挥作用，促进CTCF结合和染色质环形成，并调控对小鼠大脑发育期间NPC增殖至关重要的有丝分裂基因。

关于易基因全基因组重亚硫酸盐测序（WGBS）

全基因组重亚硫酸盐甲基化测序（WGBS）可以在全基因组范围内精确的检测所有单个胞嘧啶碱基（C碱基）的甲基化水平，是DNA甲基化研究的金标准。WGBS能为基因组DNA甲基化时空特异性修饰的研究提供重要技术支持，能广泛应用在个体发育、衰老和疾病等生命过程的机制研究中，也是各物种甲基化图谱研究的首选方法。

易基因全基因组甲基化测序技术通过T4-DNA连接酶，在超声波打断基因组DNA片段的两端连接接头序列，连接产物通过重亚硫酸盐处理将未甲基化修饰的胞嘧啶C转变为尿嘧啶U，进而通过接头序列介导的 PCR 技术将尿嘧啶U转变为胸腺嘧啶T。

应用方向：

WGBS广泛用于各种物种，要求全基因组扫描（不错过关键位点）

• 全基因组甲基化图谱课题
• 标志物筛选课题
• 小规模研究课题

技术优势：

• 应用范围广：适用于所有参考基因组已知物种的甲基化研究；
• 全基因组覆盖：最大限度地获取完整的全基因组甲基化信息，精确绘制甲基化图谱；
• 单碱基分辨率：可精确分析每一个C碱基的甲基化状态。

关于易基因染色质免疫共沉淀测序 (ChIP-seq)

染色质免疫共沉淀（Chromatin Immunoprecipitation,ChIP），是研究体内蛋白质与DNA相互作用的经典方法。将ChIP与高通量测序技术相结合的ChIP-Seq技术，可在全基因组范围对特定蛋白的DNA结合位点进行高效而准确的筛选与鉴定，为研究的深入开展打下基础。

DNA与蛋白质的相互作用与基因的转录、染色质的空间构型和构象密切相关。运用组蛋白特定修饰的特异性抗体或DNA结合蛋白或转录因子特异性抗体富集与其结合的DNA片段，并进行纯化和文库构建，然后进行高通量测序，通过将获得的数据与参考基因组精确比对，研究人员可获得全基因组范围内某种修饰类型的特定组蛋白或转录因子与基因组DNA序列之间的关系，也可对多个样品进行差异比较。

应用方向：

ChIP 用来在空间上和时间上不同蛋白沿基因或基因组定位

• 转录因子和辅因子结合作用
• 复制因子和 DNA 修复蛋白
• 组蛋白修饰和变异组蛋白

技术优势：

• 物种范围广：细胞、动物组织、植物组织、细菌微生物多物种富集经验；
• 微量建库：只需5ng以上免疫沉淀后的DNA，即可展开测序分析；
• 方案灵活：根据不同的项目需求，选择不同的组蛋白修饰特异性抗体。

技术路线：

易基因提供全面的表观基因组学（DNA甲基化、DNA羟甲基化）和表观转录组学（m6A、m5C、m1A、m7G）、染色质结构与功能组学技术方案（ChIP-seq、ATAC-seq），详询易基因：0755-28317900.

参考文献：

1、Sun D, Zhu Y, Peng W, Zheng S, Weng J, Dong S, Li J, Chen Q, Ge C, Liao L, Dong Y, Liu Y, Meng W, Jiang Y. SETDB1 regulates short interspersed nuclear elements and chromatin loop organization in mouse neural precursor cells. Genome Biol. 2024 Jul 3;25(1):175. pii: 10.1186/s13059-024-03327-2. doi: 10.1186/s13059-024-03327-2. PubMed PMID: 38961490.

2、江燕课题组合作研究揭示SETDB1调控神经前体细胞中短散在核元件和染色质环构象的分子机制 (fudan.edu.cn)

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