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2022年8月11日,南方科技大学王玉琨教授团队以“Comprehensive Analysis of the Transcriptome-wide m6A Methylome in Lung Adenocarcinoma by MeRIP Sequencing”为题在《Frontiers in Oncology》杂志上发表研究论文,通过MeRIP-seq和对应的转录组测序(RNA-seq)联合分析验证了m6A甲基化修饰与肺腺癌(LUAD)进展之间的强关联。
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标题:Comprehensive Analysis of the Transcriptome-wide m6A Methylome in Lung Adenocarcinoma by MeRIP Sequencing(通过MeRIP-seq全面分析肺腺癌转录组范围的m6A甲基化组)
时间:2022.08.11
期刊:Frontiers in Oncology
影响因子:IF 5.738
技术平台:MeRIP-seq(m6A-seq)、mRNA-seq
样本:3个肺腺癌(LUAD)样本和3个癌旁正常组织样本,共6个样本
实验:MeRIP-seq、mRNA-seq、甲基化组与转录组关联分析、结合公共数据库分析、实验验证(qPCR、RIP-qPCR)
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摘要:
N6-甲基腺苷(m6A)是真核mRNA上最丰富的修饰。越来越多的证据表明m6A在肿瘤进展中起关键作用,因此分析肺腺癌(lung adenocarcinoma,LUAD)转录组范围内的m6A修饰非常重要。本研究采集三对LUAD组织样本和癌旁正常组织样本,利用甲基化RNA免疫沉淀测序(MeRIP-seq)和RNA测序(RNA-seq)来鉴定肿瘤和癌旁正常组织之间的差异m6A修饰。共鉴定出4041个异常m6A peaks,其中1192个m6A peaks上调,2849个m6A peaks下调,失调的m6A peak基因在癌症、Rap1信号通路和胰岛素抵抗通路中富集。
对MeRIP-seq和RNA-seq数据进行联合分析,鉴定出612个m6A peaks和RNA表达异常调控基因。KEGG分析鉴定出612个基因在癌症相关信号通路中富集,包括cGMP-PKG信号通路和Rap1信号通路。GSEA富集分析表明,这些基因在细胞周期相变、细胞分裂、细胞对DNA损伤刺激响应和染色体组织中富集。
为进一步研究差异m6A修饰基因与LUAD患者临床参数之间的关系,作者搜索了癌症基因组图谱(TCGA)并鉴定了2个与LUAD患者预后和诊断相关的基因——FCRL5和GPRIN1。同时,在GEPIA2数据库中发现GPRIN1和m6A reader YTHDF1之间呈正相关,证明了YTHDF1与GPRIN1 mRNA结合并调控其表达。本研究结果表明,m6A修饰在LUAD的进展和预后中起重要作用,可能是未来LUAD患者潜在的新治疗靶点。
结果图形
(1)LUAD 中的 m6A 甲基化图概述
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图1:LUAD中m6A甲基化特征
- 排名前三的m6A motif。
- m6A peak在正常和肿瘤组织中的分布图。
(C, D) 差异m6A peak的分布图。
(E)直方图显示正常和肿瘤样本之间 m6A 富集的变化。(F)显著差异m6A peak 火山图。
(G)每个 mRNA 变化的 GGAC 序列的分布。
(H)差异 m6A peak在染色体上的分布。
表1:LUAD组织与正常组织的前20个m6A甲基化peaks
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(2)含有m6A基因参与重要的生物学过程和通路
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图2:差异 m6A 基因的 GO 功能富集和 KEGG 通路富集
- 下调m6A peak基因的前 10 GO类别图。
- 上调m6A peak基因的前 10 GO类别图。
- 下调m6A peak基因的前 10 KEGG 通路图。
- 上调m6A peak基因的前 10 KEGG 通路图。
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图3:肿瘤和正常组织之间的差异甲基化基因GO富集分析
(3)转录组图谱及MeRIP-seq与RNA-seq数据的联合分析
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图4:MeRIP-seq与RNA-seq数据的联合分析
- 差异表达基因火山图。
- 差异表达基因热图。
- 四象限图显示了 m6A 修饰和 RNA 水平均发生显著变化的基因分布。
- m6A 修饰和 mRNA 水平均发生显著变化基因的前 10 GO 类别图。
- m6A 修饰和 RNA 水平均发生显著变化基因的前10 KEGG通路 图。
(F、G、H、I)m6A 修饰和 RNA 水平均发生显著变化基因的GSEA富集图。
表2:肿瘤组和正常组m6A-seq&RNA-seq的前20个差异基因
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(4)鉴定含有m6A修饰的2个基因与LUAD患者的临床参数相关
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图5:m6A修饰调控的基因表达与TCGA数据库中临床参数的关系
- 本研究中的基因与 TCGA 数据库的交集。
- 前20 个基因的单变量 Cox 回归分析。
(C、D)分别为 GPRIN1 和 FCRL5 的总体生存曲线。(E) GPRIN1 表达与 N 的关系。
(F, G, H) FCRL5 表达与 M、N 和临床分期的关系。
(I, J) GPRIN1 和 FCRL5 的ROC曲线(N:淋巴结转移;M:远处转移。)
表3:肿瘤组和正常组中m6A-seq&RNA-seq&TCGA)的前20个差异基因
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图6:m6A reader YTHDF1 调控 GPRIN1 表达
- GEPIA2 数据库中 YTHDF1 和 GPRIN1 之间存在强正相关。
(B,C)分别在 CPTAC 数据库中 YTHDF1 和 GPRIN1 的蛋白质表达。
(D) GPRIN1 的m6A peak分布。
(E) YTHDF1 的敲低下调了 LUAD A549 细胞中 GPRIN1 的 RNA 水平。
(F)通过 RT-qPCR 测量 A549 细胞中 RIP 衍生的 RNA。
结论:
本研究利用MeRIP-seq和mRNA-seq技术,证明了 m6A 修饰与 LUAD 进展之间强关联。筛选出了2个与LUAD患者的预后和诊断相关的基因(FCRL5和GPRIN1)。此外,还发现 GPRIN1 作为 YTHDF1 的下游目标。
关于易基因RNA m6A甲基化测序(MeRIP-seq)技术
易基因MeRIP-seq技术利用m6A特异性抗体富集发生m6A修饰的RNA片段(包括mRNA、lncRNA等rRNA去除所有RNA),结合高通量测序,可以对RNA上的m6A修饰进行定位与定量,总RNA起始量可降低至10μg,最低仅需1μg总RNA。广泛应用于组织发育、干细胞自我更新和分化、热休克或DNA损伤应答、癌症发生与发展、药物应答等研究领域;可应用于动物、植物、细胞及组织的m6A检测。
大样本量m6A-QTL性状关联分析,传统MeRIP单个样品价格高,通常难以承担。易基因开发建立MeRIP-seq2技术,显著提成IP平行性,实现不同样本间相对定量,降低检测成本。
易基因提供适用于不同科研需求的MeRIP技术:
- m6A甲基化-常量mRNA 甲基化测序(MeRIP-seq)
- m6A甲基化-常量mRNA +lncRNA甲基化测序(lnc-MeRIP-seq)
- m6A甲基化-微量mRNA +lncRNA甲基化测序(Micro-lnc-MeRIP-seq)
- 高通量m6A甲基化-常量mRNA甲基化测序(MeRIP-seq2)
技术优势:
- 起始量低:样本起始量可降低至10-20μg,最低仅需1μg总RNA;
- 转录组范围内:可以同时检测mRNA和lncRNA;
- 样本要求:可用于动物、植物、细胞及组织的m6A检测;
- 重复性高:IP富集重复性高,最大化降低抗体富集偏差;
- 应用范围广:广泛应用于组织发育、干细胞自我更新和分化、热休克或DNA损伤应答、癌症的发生与发展、药物应答等研究领域。
研究方向:
m6A甲基化目前主要运用在分子机制的理论性研究
- 疾病发生发展:肿瘤、代谢疾病(如肥胖/糖尿病)、神经和精神疾病(如阿尔兹海默症/抑郁症)、炎症…
- 发育和分化:早期胚胎发育、个体/组织/器官生长发育、干细胞分化与命运决定、衰老
- 环境暴露与响应:污染、抗逆、生活方式
关于m6A甲基化研究思路
(1)整体把握m6A甲基化图谱特征:m6A peak数量变化、m6A修饰基因数量变化、单个基因m6A peak数量分析、m6A peak在基因元件上的分布、m6A peak的motif分析、m6A peak修饰基因的功能分析
(2)筛选具体差异m6A peak和基因:差异m6A peak鉴定、非时序数据的分析策略、时序数据的分析策略、差异m6A修饰基因的功能分析、差异m6A修饰基因的PPI分析、候选基因的m6A修饰可视化展示
(3)m6A甲基化组学&转录组学关联分析:Meta genes整体关联、DMG-DEG对应关联、m6A修饰目标基因的筛选策略
(4)进一步验证或后期试验
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易基因科技提供全面的RNA甲基化研究整体解决方案,技术详情了解请致电易基因。
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参考文献:
Mao W, Yu Q, Wang K, Ma Q, Zheng Y, Zhang G, Luo W, Wang N, Wang Y. Comprehensive Analysis of the Transcriptome-wide m6A Methylome in Lung Adenocarcinoma by MeRIP Sequencing. Front Oncol. 2022;12:791332.
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