Disease-induced changes in plant microbiome assembly and functional adaptation
Gao et al. Microbiome
(2021) 9:187
https://doi.org/10.1186/s40168-021-01138-2
Min Gao1,2, Chao Xiong3, Cheng Gao1,2, Clement K. M. Tsui4,5,6, Meng-Meng Wang1,2, Xin Zhou1,2,
Ai-Min Zhang7 and Lei Cai1,2*
疾病诱导的植物微生物组装与功能适应的变化
摘要
背景：植物的微生物群落是宿主的一个不可分割的部分，越来越多地被认为在植物的生长和健康中起到基础作用。越来越多的证据表明植物根际吸引有益的微生物到植物，以抑制土传病原体。然而，病原体侵入时在地下和地上部分控制植物微生物群落组装和功能的生态过程尚不完全了解。在这里，我们研究了与辣椒（Capsicum annuum L.）的12个部分（例如，土壤，根，茎和果实）相关的细菌和真菌群落，使用扩增子（16S 和 ITS）和宏基因组学方法在中国的主要辣椒生产地，并调查枯萎病（FWD）如何影响与植物相关的微生物的组装，共现模式和生态功能。
结果：扩增子数据分析显示，枯萎病（FWD）对辣椒生殖器官（果实）的微生物组的影响较小，而对营养器官（根和茎）的影响较大，尤其对上部茎的表皮影响最为明显。真菌内部的网络稳定性较差，其群落对FWD的敏感性也高于细菌群落。微生物间的网络分析进一步指示，FWD破坏了网络稳定性，并增加了真菌分类群的生态重要性。尽管患病植物更容易被其他致病真菌侵染，但其地下和地上的部分也可以招募到可能有益的细菌。在患病植物中富集的一些有益细菌也被确定为植物微生物组的核心分类群和网络中的中心分类群。另一方面，宏基因组学分析揭示了患病植物中涉及解毒、生物膜形成和植物-微生物信号途径（即，趋化作用）的几个功能基因的显著富集。
总结：总之，我们证明了一个患病的植物能够招募有益的细菌，并减轻生殖器官微生物组的变化，以促进宿主或其后代的生存。宿主植物可能通过调节植物-微生物信号途径来吸引有益的微生物。这些发现显著地推进了我们对植物-微生物相互作用的理解，并为利用植物微生物组在可持续农业中提供了基础和重要的数据。
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背景：植物及其相关的微生物群落已共同演化超过4亿年，并形成一个“整体生物体”（holobiont），其中植物-微生物相互作用在宿主功能和适应性的许多方面起着至关重要的作用，包括营养获取、非生物胁迫的耐受性和疾病抑制。因此，操纵植物的微生物群落日益被认为是一种环境可持续的方法来保护植物免受疾病的侵害并促进农业生产。揭示决定植物相关微生物群落的组装、共生模式和功能的基本生态模式，以及植物宿主如何在外部压力下调节其微生物群落，是为了利用植物微生物群落来增强植物健康和最大化作物生产的先决条件。
植物微生物群落的组装受多种生物和非生物因素的影响，例如宿主选择（例如，植物部分和宿主遗传）、气候和土壤类型。除了宿主选择和食草昆虫外，病原体入侵是影响植物微生物群落组装的最重要的生物胁迫之一。关于小麦、甜菜和拟南芥的越来越多的研究显示，病原体感染的植物的根可以吸引有益的微生物进行救援或保护未来的代代（即，“呼救”策略）。宿主植物可以通过释放挥发性有机化合物（VOCs）或修改特定根分泌物的合成和分泌来吸引有益的微生物。作为植物微生物群落的关键分类群的有益微生物可以通过引发植物免疫系统、分泌抗生素化合物和与病原体竞争资源来促进植物疾病的抑制。除了根部外，我们对其他植物器官（例如，茎和果实）是否在病原体感染下使用类似策略寻求微生物的益处仍然知之甚少。
越来越多的实验和观察性文献提供了证据，表明根际是植物的一个关键区域，其微生物群落与植物的表现密切相关。另一方面，叶际微生物群落，即栖息在植物空中部分的微生物，可能在植物健康、生产力和生态系统功能中发挥着至关重要但常被忽视的作用。几项最近的研究表明，上部病原体的感染改变了植物的根际微生物群落。此外，作为叶际微生物群落的种子库的根际微生物群落在决定上部生产力和健康方面起到关键作用。Bai等人在拟南芥中建立了叶和根来源的微生物群落，并发现它们之间存在广泛的分类重叠。总体上，上述研究表明，植物的地下和地上微生物群落是系统性地联系在一起的。然而，迄今为止，大多数相关研究通常都集中在根际或叶际微生物群落上，而对病原体入侵下的根际、叶际和内部微生物群落的结构和功能的系统性理解仍不清楚。此外，微生物群落的组装在很大程度上受到执行对植物健康整体有益功能的众多微生物成员之间的合作和竞争相互作用的影响。共生网络分析越来越多地被用来推断潜在的微生物间连接，并基于拓扑属性查询群落的稳定性。根据理论建模和模拟数据，具有更大模块化、成员间更低的正相关性和更高的负相关性的微生物网络更为稳定。然而，我们对复杂的植物相关微生物群落内的潜在相互作用，以及它们如何响应病原体入侵的了解仍然很少。
枯萎病(FWD)通常由Fusarium oxysporum物种复合体引起，这是一种典型的土传病，攻击各种经济重要的农作物，包括香蕉、西瓜和茄科植物（例如：番茄、茄子和辣椒）。病原体通过根部进入并干扰植物的导水组织，导致褐色导管束的形成和枯萎症状。辣椒(Capsicum annuum L.)是全球主要的农作物之一，据联合国粮农组织统计，中国的辣椒产量占全球的50%以上。椒类的FWD是由F. oxysporum f. sp. capsici引起的，每年都导致严重的生产损失。
植物由不同的器官组成，这些器官可以被分类为营养器官（根、茎和叶）和生殖器官（果实、花和种子），每种器官都有特定的功能。由于植物可能增强后代的适应性，我们假设疾病会对营养器官的影响比对生殖器官更为严重，并且感染的植物会招募保护性微生物来抑制病原体的生长。此外，考虑到真菌群落对植被变化的反应比细菌群落更为敏感，而且真菌是植物地下碳源的第一消费者，我们还预期辣椒的真菌群落对FWD的敏感性比细菌群落更高。最后，考虑到许多证据将分类组成与生态功能联系起来，我们假设由疾病引起的分类组成的变化会影响微生物群落的功能适应。为了验证这些假设，我们在中国贵州，一个FWD发病率高且辣椒是重要作物的地方，研究了FWD对辣椒微生物群落的影响。使用辣椒-FWD系统，我们的目标是探索健康和患病植物的微生物群落在分类和功能上的差异，使用扩增子(细菌和真菌)和宏基因组测序。我们还比较了健康和患病植物微生物群落的网络，以提供对群落稳定性以及倾向于相互出现的微生物的见解。
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材料和方法
取样
所有样品均采自中国西南部贵州省的荔波（25° 48′ 41″ N, 106° 31′ 24″ E）和贵阳（26° 29′ 31″ N, 106° 39′ 16″ E；两地相距92.1 km）的主要辣椒生产田。这两个地点位于亚热带季风气候区，年平均温度相同，为15.8°C，年平均降水量分别为1213.4 mm和1259.8 mm。使用的辣椒品种与当地农民种植的相同（即线辣椒），在荔波为长啦8号，而在贵阳为N1713。2018年8月在两地都对成熟的辣椒进行了采样。在每个地点，那些没有枯萎症状并经测试为病原体阴性的辣椒植物被归类为健康；那些显示枯萎、褐色导管束症状并经测试为病原体阳性的植物（通过形态和分子数据确认；引物列于表S1）被归类为病患（图S1）。每个地点从三个相邻的地块收集了三份健康和病患植物的重复样品。每个重复样品由混合三个单独样品得到。在收集植物样品时，从根部20 cm处、深度为0-15 cm的地方收集了一个大块土壤样品。通过手动摇动从根部收集根际土壤（定义为附着在根上的土壤）。每株植物的植物样品及其相应的根际和大块土壤都用干冰运送到实验室，并存放在−80°C的冷冻条件下，以供进一步实验。
DNA提取和扩增子测序
根和果实样本分为表皮和内皮部分，分别代表根和果实表面或器官内的微生物。对于从表皮提取微生物DNA，10-20克的果实或3-5克的根（在使用无菌棉签从根部仔细去除大块土壤后得到）被放入含有释放缓冲液的无菌瓶或聚苯乙烯管中（0.1M磷酸钾、0.1%甘油、0.15%吐温80，pH 7.0；果实分析用150ml，根分析用35ml）并在40kHz下超声处理1分钟。然后样品在200转每分钟的摇床上摇晃4分钟。这个步骤重复两次。洗涤液随后过滤于0.22μm的硝酸纤维膜过滤器（BOJIN, 德国）上。含有表皮微生物的滤膜在DNA提取前存放在-80°C。
对于从内皮提取微生物DNA，约5克的果实或根如上述方法处理以去除表皮生物。然后，植物材料用70%的酒精冲洗5分钟，5.25%的次氯酸钠溶液冲洗5分钟，70%的酒精冲洗30秒，最后用无菌H2O冲洗五次，进行表面灭菌。处理后的果实和根样本使用无菌研钵和研杵研磨并在-80°C冷冻。辣椒茎样本被分为上茎部分、中茎部分和底茎部分，每部分进一步分为表皮和木质部（图S2）。表皮和木质部的部分使用液氮和无菌研钵及研杵研磨。从样品中提取总DNA使用FastDNA SPIN Kit for Soil（MP Biomedicals, Solon, 美国）按照制造商的说明。
总体上，每个植物样品被分为12个部分：大块土壤（BulkS）、根际土壤（RHS）、根表皮（Repi）和内皮（Rendo）、底茎表皮（BS-epidermis）和木质部（BS-xylem）、中茎表皮（MS-epidermis）和木质部（MS-xylem）、上茎表皮（US-epidermis）和木质部（US-xylem）、以及果实表皮（Fepi）和内皮（Fendo）（图1a和图S2）。
细菌16S rRNA基因的V5-V6区域（799F/1115R）和真菌ITS2区域（fITS7/ITS4）被扩增（详见附加文件1；引物序列和PCR扩增条件见表S1）。扩增子文库在Illumina HiSeq2500平台上进行测序（MEGIGENE Biological Company, 广东, 中国）。
扩增子测序数据分析
细菌的16S rRNA基因和真菌的ITS序列使用USEARCH v10.0 和 QIIME v1.9.1 进行处理。简而言之，对于低于Q30的打分进行修剪并去除引物序列。16S和ITS的配对读取被合并为单一序列。ITS读取被修剪至200bp并进行质量过滤（最大预期错误0.5）。使用unoise3 以默认参数在100%序列相似度下识别生物读取。使用SILVA参考数据库(v12_8) 和UNITE数据库(v7.0) 分别对细菌和真菌进行分类。分配给叶绿体、线粒体或绿色植物的细菌零半径分类单元(ZOTUs)，以及分配给植物或原生动物的真菌ZOTUs都被移除。由少于两个序列代表的ZOTUs也被移除以避免可能的偏见。
积累和缩放（CSS）被用作细菌和真菌beta-多样性分析的规范化方法 。细菌和真菌群落的Alpha多样性和Beta多样性指数在QIIME v1.91中计算（使用single_rarefaction.py, alpha_diversity.py, 和beta_diversity.py脚本）；细菌和真菌的ZOTU表格被稀释至10,250和5,005读取以估计Alpha多样性指数。正如之前的研究，健康和患病植物微生物组的核心分类群被定义为在100%的健康和患病植物样品中都存在的ZOTUs。真菌ZOTUs使用在线应用FUNGuild (http://www.stbates.org/guilds/app.php) 分配到功能公会。为了保持高准确性，保留了“高度可能”和“可能”的置信度排名。
宏基因组测序工作流程和数据分析
基于扩增子测序数据，选择了在Huishui地点收集的上茎表皮和根内生体样本进行宏基因组测序和特征分析。使用Illumina NovaSeq 6000仪器（Majorbio Biopharm Technology, 上海, 中国）对十二个DNA样本进行150-bp配对末端读取。每个DNA样本获得了约20 GB的清洁数据。为了去除宿主衍生的序列，使用Bowtie2 v2.4.1 构建了一个宿主基因组数据库（C. annuum cultivar Zunla-1, NCBI参考序列 ASJU00000000.1）,然后将宏基因组数据与宿主基因组数据库进行了映射。使用MEGAHIT v1.2.9 [68]组装剩余的读取，使用Prokka v1.14.5 预测基于联接的基因，并使用CD-HIT v4.8.1按0.95相似性阈值进行聚类，以生成非冗余基因目录。使用eggnog-mapper v1.0.3 基于DIAMOND比较和eggNOG数据库(v5.0) 进行功能注释。注解结果重新组织为Kyoto基因和基因组百科全书(KEGG) Orthology (KO)档案, 蛋白质同源群簇(COG)功能类别, 和 CAZymes (CAZ) 。使用ResFams 检测和重组抗生素抗性基因。使用QIIME v1.91(使用single_rarefaction.py, alpha_diversity.py, 和beta_diversity.py脚本)计算功能多样性，使用R中vegan包中的beta-disper函数测试FWD对功能差异性的影响。通过LDA效应大小(LEfSe)分析(Galaxy网络应用程序, http://huttenhower.sph.harvard.edu/galaxy/)探索健康和患病植物微生物组之间功能基因的差异丰度。使用Kraken 2 推断宏基因组序列数据的分类，该工具生成k-mer匹配，实现高准确性和快速分类速度。使用Bracken, Kraken 2的配套程序，计算物种丰度。
统计分析
Alpha多样性指数（例如Shannon指数和Chao1指数）使用QIIME v1.91（alpha_diversity.py）进行计算。通过Wilcoxon秩和检验测试健康和病态植物的每个隔室样品之间的差异。线性混合模型（LMMs）被用来识别alpha多样性指数和群落组成（门和纲水平）的主要驱动因子。使用二型方差分析（ANOVA）比较变量强度，并为模型计算R2。
使用Bray-Curtis距离矩阵计算并使用非度量多维缩放（NMDS）排序进行可视化，以评估细菌和真菌群落的beta多样性。为了确定不同因子对群落差异性的影响，执行了基于排列的多变量方差分析（PERMANOVA）统计检验，使用vegan R包中的“adonis”，进行1999次排列并使用Bray-Curtis距离矩阵作为输入。PERMANOVA还用于测试FWD和采样点在单独隔室中的影响。为了计算beta-离散度，执行了vegan R包中的betadisper函数，这是Levene’s关于方差均匀性检验的多变量类似物。使用“edgeR”R包中的EdgeR的广义线性模型（GLM）方法计算健康和患病植物微生物组之间的差异丰度，使用修剪的M值均值（TMM）标准化方法和P < 0.001的显著性阈值。
共现网络分析
共现模式是通过基于属级矩阵计算多种丰度相关性来重建的，使用Cytoscape中的共现网络(CoNet)应用程序来完成[84]。如果Spearman的相关系数(ρ)大于0.70且P值小于0.05，则认为共现是稳健的。使用Benjamini–Hochberg程序调整P值以最小化误报正信号。网络使用交互式平台Gephi进行可视化。节点代表单一的微生物属，边代表微生物组网络中节点之间的两两关联，表明生物学上或生化上有意义的相互作用。
计算的细菌和真菌网络的拓扑特征包括共现(正)和相互排斥(负)相关性的数量、平均路径长度、网络直径、平均聚类系数、平均连通性和模块性。基于拓扑特征的度数和接近中心性来确定单个节点的角色。每个网络中的中心类群被确定为具有最高度数和接近中心性的前10个节点。通过负相关或正相关的比例以及模块性来测量网络的稳定性。
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结果
FWD影响辣椒微生物组的组装
总共从144个样本中获得了8,672,206个细菌16S rRNA和7,677,988个真菌ITS高质量读数。这些读数被分类为14,976个细菌ZOTUs和4,277个真菌ZOTUs。为了检查形成辣椒微生物组的各种因素的维度，我们评估了植物部位、FWD和采样地点等多个因素对微生物群落形成的相对贡献。NMDS排序和PERMANOVA分析显示，对总体微生物组影响最大的是部位（细菌的R2 = 0.47，真菌的R2 = 0.53，两者都是P < 0.001），其次是FWD（细菌的R2 = 0.06，真菌的R2= 0.03，两者都是P <= 0.001），然后是采样地点（细菌的R2= 0.01，真菌的R2= 0.02，两者都是P < 0.001）(图1b和表S2)。在根部内生、底部茎表皮、中部茎表皮和木质部、上部茎表皮和木质部以及果实表皮，FWD解释的真菌群落变异比细菌群落的更大(图1c、表S3和表S4)。值得注意的是，FWD对辣椒果实中的真菌群落的影响较小，而对茎和根中的群落影响较大(根/茎/果实的R2分别为：0.17/0.22/0.13，平均值；图1c和表S4)。同样，FWD对细菌群落的影响在茎部比果实更强(茎/果实的R2分别为：0.16/0.13，平均值；图1c和表S3)。对于茎，FWD对表皮的细菌和真菌群落的影响都比对木质部更为明显(细菌/真菌，R2平均值分别为：0.19/0.29和0.12/0.145) (图1c、表S3和表S4)。在所有部位，FWD对上茎表皮和根内生的真菌群落影响最大(R2 = 0.39, P <= 0.001在上茎表皮; 和R2 = 0.25, P <= 0.001在根内生)(图1c和表S4)。相比之下，采样地点解释的细菌群落的变异比FWD在大部分部位都高(图1c和表S3)。此外，基于Bray-Curtis相异性，病植物中的细菌(P = 0.012)和真菌群落(P = 0.037)比健康植物中的更为变异(图1d)。对于每一个部位，在散装土壤、根内生、底部茎表皮和木质部、上部茎表皮以及果实表皮，病植物中的细菌群落比健康植物中的更为变异(表S5)。在散装土壤、根际土壤、中茎木质部、上茎表皮和果实表皮，病植物中的真菌群落比健康植物中的更为变异(表S5)。
我们使用LMMs进一步探索微生物α多样性的最主要驱动因子。分析揭示，植物部位是影响基于Shannon多样性指数的细菌和真菌群落α多样性的主要因素(P < 0.0001, 表S6)。FWD对α多样性的影响在真菌(P = 0.00172)和细菌(P = 0.023, 表S6)群落上都是显著的。在FWD下，上茎表皮、底茎表皮、根内生和根际土壤的真菌α多样性显著低于健康植物(P < 0.05, 图1f)。采样地点对细菌群落的α多样性有显著影响(P = 0.006)；但对真菌群落的α多样性没有显著影响(P = 0.831, 表S6)。此外，果实中的真菌群落的α多样性在Shannon多样性指数和Chao1丰富度指数方面与散装土壤中的没有显著差异(P > 0.05, 图S5b和d)。
在健康植物中，我们鉴定出25个核心细菌类群和12个核心真菌类群；在病植中，我们鉴定出23个核心细菌类群和16个核心真菌类群(附加文件2)。在这些核心类群中，20个细菌类群和12个真菌类群同时出现在健康和病植中。关于组成的变化，LMM分析指示FWD对腐生(酵母)功能类群中属于Tremellomycetes纲的相对丰度有显著影响(P < 0.05)，但对任何细菌门都没有影响(图2b, 图S5h, 图S6a和b, 和表S7)。差异丰度分析也指示在两个采样地点的病植茎中Tremellomycetes的丰度增加(图S9和图S10b)。与相应部位的健康植物样本相比，病植的茎表皮比木质部在两个采样地点的类群丰富度和稀缺度更为明显(P < 0.001, 图S7-S9)。从Diaporthe、Fusarium、Phomopsis、Plectosphaerella、Stemphylium和Cryptococcus属的几种潜在病原真菌在病植的根和茎中的相对丰度也显著高于健康植物(P < 0.001, 图2b和d)。三个在病植中显著丰富的Fusarium ZOTUs (ZOTU4, ZOTU10, 和ZOTU15)也被鉴定为在健康和病植中的核心真菌类群(图2d和f, 附加文件2)。但是，从Pseudomonas、Streptomyces、Klebsiella、Enterobacter、Microbacterium、Bacillus、Chitinophaga和Citrobacter属的几种潜在有益细菌在病植中显著丰富(P < 0.001, 图2b a 和 c, 和图S6c)。对于每个地点，在病植中丰富的前3种潜在有益细菌分别属于Guiyang的Streptomyces、Microbacterium和Pseudomonas，以及Huishui的Bacillus、Bacillus和Pseudomonas(P < 0.001, 图S10c)。此外，一些在病植中显著丰富的潜在有益细菌，包括Streptomyces (ZOTU2)、Pseudomonas (ZOTU16)、Pseudomonas (ZOTU17)和Bacillus (ZOTU30)也被鉴定为在健康和病植中的核心细菌类群(图2c和e, 附加文件2)。
FWD影响辣椒微生物共生网络
为了研究FWD如何影响辣椒微生物的共生模式，我们分析了细菌-细菌和真菌-真菌的同界网络，以及细菌-真菌的跨界网络。基于同界网络分析，我们记录到在细菌网络中有更高的负边和模块度的比例(健康的负边/模块度比例：37.8%/0.464，FWD的比例：19.9%/0.501)比在真菌网络中(健康的负边/模块度比例：0%/0.269，FWD的比例：1%/0.317；表S10)。我们还记录到在细菌网络中有更多的节点和边比在真菌网络中(图3a，表S10)。此外，与高度和紧密度中心值的前10个中心节点的边在细菌网络中主要与其他节点呈负相关，尤其是在健康网络中(图3b和c)。相比之下，真菌网络的大多数边主要呈正相关(图3b和c)。此外，健康植物的细菌网络比病植的更复杂(基于节点和边的数量)，但真菌网络观察到了相反的模式(图3b，d和e和表S10)，特别是在Huishui地点(图S11d)。
跨界共生网络进一步指出FWD破坏了网络并增加了真菌类群之间的同界相关性。健康网络的负边和模块度的比例高于病植网络(健康的负边/模块度比例：42.8%/0.535，病植的比例：34.9%/0.524；表S10)。真菌类群的节点和边在病植网络中比在健康网络中更多，而细菌类群观察到了相反的模式(图4a-c，图S11e和表S10-S11)。BF(细菌-真菌)跨界相关主要是负的(健康网络中为92.1%，病植网络中为78.3%)，而正相关主导了同界相关(健康植物网络中为60% BB和98% FF，病植网络中为66% BB和99% FF)(图4d)。健康网络中的前10个中心类群都是细菌，而真菌类群在病植网络中占了前10个中心的一半(图4e和表S12)。在大多数单一部位网络中都观察到了相似的模式(图S12)。此外，一些在病植中富集的细菌类群，如Microbacterium、Streptomyces和Pantoea，也被鉴定为网络中的顶级中心类群(表S8，表S12和附加文件2)。
FWD影响辣椒微生物组功能
我们使用宏基因组测序方法来探索可能由FWD引起的与辣椒相关的微生物组的功能转变。由于上茎表皮和根内部微生物组对FWD的反应比其他部位更强烈，我们从Huishui地点选择了这两个部位进行宏基因组测序。宏基因组测序数据被分配到6296种细菌物种和57种真菌物种。群落组成的差异丰度分析显示，与健康植物相比，病植的根内部和上茎表皮部位中的几种潜在有益细菌，如Enterobacter、Klebsiella、Citrobacter和Pseudomonas，显著富集(P<0.001, 图5a)。几种潜在的致病真菌，如Fusarium和Cryptococcus，在病植中比在健康植物中更为丰富(P<0.05, 图5b)。这些观察结果与扩增子测序数据(图2c和d)是一致的。
宏基因组分析显示，与健康植物相比，病态上茎表皮微生物组的功能组成(即KO、CAZ和ResFam的NMDS排序)有显著差异 (P < 0.05, 图5c)，但根内部微生物组则没有这种差异 (图S14a)。虽然FWD与上茎表皮微生物组的KO (P = 0.0314)、COG (P = 0.0074)和Resfam (P = 0.0065)功能多样性的降低有关，但我们没有在根内部微生物组中观察到功能多样性的显著变化 (图5d)。
为了确定FWD如何影响微生物组的功能特性，我们进行了差异丰度分析。与健康植物相比，病态上茎表皮中特异富集或减少的微生物组功能特性的数量要高于根内部 (表S13)。与健康植物相比，病态根内部微生物组中phoD碱性磷酸酶基因 (K01113) 和mprF肽类抗生素抗性基因被减少，而病态上茎表皮微生物组中的抗万古霉素基因簇则被减少 (P < 0.05, 图5e, 图S14c和f, 和表S14)。此外，与LuxR家族转录调节因子 (K04333) 相关的功能基因csgD在病态根内部微生物组中富集；与UDP-葡糖醛酸转移酶 (GT1) 和复制、重组和修复 (COG_L) 有关的模块在病态上茎表皮微生物组中富集 (P < 0.05, 图5e, 图S14c-e, 和表S14)。此外，根据KO简档，与植物-微生物组信号通路有关的一些功能基因在病态根内部微生物组中比在健康植物中更为丰富。例如，与甲基受体趋化性蛋白 (MCPs; K03406, K05874, K05875, 和K11525) 相关的基因在病态根内部微生物组中相对于健康植物增加了33.2-218.2% (图5f)。与MCPs下游相关的功能基因，如组氨酸激酶CheA (K03407) 和嘌呤结合的趋化性蛋白CheW (K03408)在病态根内部微生物组中相对于健康植物也增加了15.0-40.3% (图5f)。
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讨论
在这项研究中，我们使用扩增子和宏基因组方法探讨了FWD对辣椒微生物组的影响。通过对健康和FWD辣椒植物的十二个地下和地上部分的细菌和真菌群落进行分析，我们发现与细菌群落相比，真菌网络更不稳定，其群落对FWD更敏感。FWD对植物体器官的微生物组装有更强烈的影响，而对生殖器官的影响较小，对上茎表皮和根内生态影响最大。这两个部分的宏基因组测序数据进一步表明，在FWD植物中，与解毒、生物膜形成和植物-微生物组信号通路(如趋化性)有关的一些功能基因明显富集。此外，我们的研究还提供了证据，除了根之外，辣椒植物的其他器官，如茎和果实，也可以将潜在的有益细菌招募到FWD植物中。通过这项研究，我们提供了证据，FWD不仅改变了微生物群落的多样性、组装和网络，还影响了它们的生态功能。以下，我们讨论了这些发现是如何推进我们对疾病诱导的植物微生物组装、共生模式和功能变化的理解的。
首先，我们的发现表明，辣椒植物的微生物组对FWD是敏感的。这与其他植物-微生物互作体系中的观察结果一致，即疾病或其他生物胁迫因子可以显著改变植物微生物组的结构和功能。这种变化可能是植物为了应对胁迫而调整其与微生物之间的相互作用的结果。
其次，我们发现真菌群落比细菌群落更易受到FWD的影响，这强调了在疾病条件下植物微生物组稳定性的重要性。不稳定的微生物组可能会导致植物更容易受到病原体的侵害，从而加剧疾病的严重性。
最后，我们的研究还揭示了植物微生物组功能变化的具体机制。例如，与解毒、生物膜形成和信号转导有关的功能基因在FWD植物中显著富集，这可能是植物为了应对FWD而调整其与微生物的互作关系的结果。
总的来说，这项研究为我们提供了关于疾病如何影响植物微生物组的宝贵见解，并为进一步探索植物与其微生物合作伙伴之间在疾病条件下的互作提供了基础。
本研究探讨了FWD（枯萎病）对植物生殖器官微生物组的影响较为轻微，而对植物营养器官的影响较大。
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生命历史权衡策略：我们的研究表明，植物可能已经进化出一种生命历史权衡策略，以确保下一代（果实和种子）的生存，而不是在当前患病的个体上投资。次生代谢产物，如辣椒素，可能保护辣椒果实和种子免受真菌病原体的侵害。
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上茎外皮对FWD的反应更强：与其他土壤和植物部分相比，上茎外皮对微生物群落的FWD影响最为明显。FWD对植物生理特性的改变，如水关系，可能强烈影响植物的地上部分。对于茎，FWD对上茎外皮中的细菌和真菌群落的影响比对木质部中的群落更为显着。与木质部相比，外皮是微生物的更有利生境，因为它更容易获得有机营养（如小糖）。
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根的反应：对于根部，FWD对内质中的细菌和真菌群落的影响较大。本研究并未单独考虑到表皮和木质部。表皮是宿主和环境之间的重要界面，而根表皮的微生物群落受到宿主选择和土壤特性的共同决定。由于真菌是植物来源的碳的重要消费者，根内质中的真菌群落可能对FWD反应强烈。
在大多数部分中，患病植物的微生物群落比健康植物的更为变化。这与基于均质选择的预期相反，即相同的环境选择压力通常导致相似的群落结构。植物相关的微生物群落受到多种宿主和环境因子的影响，如植物部分、宿主遗传学和土壤因子。最近的研究表明，宿主选择（即，部位生态位和宿主种类）在塑造植物微生物组方面的决定性效应比环境因子更大。在此观察到的对辣椒植物宿主部位的显著效应，也在高粱和杨树中被观察到。当前的研究为植物微生物组装的生态位占据理论在健康和疾病状态下提供了额外的证据。观察到宿主部位对微生物群落组成的主导效应，我们提出疾病可能减少植物的效应，并因此在患病植物中增强群落的差异性。
真菌群落对FWD比细菌群落更敏感
微生物物种之间的合作和竞争互作以及网络模块性可能影响群落稳定性 。在本研究中，健康和患病植物的细菌网络及其中心类群的特征是，与真菌网络相比，它们具有更高比例的负相关性。相互的负面互动，表明生态竞争，可以通过减少合作的不稳定效应来提高微生物群落的稳定性 。宿主可能从微生物竞争中受益，这会增强对外部压力的抵抗力 。与细菌群落相反，真菌群落受到FWD的影响更大，可能是由于与健康网络相比，FWD网络中观察到的真菌类群之间的正向内部王国相关性增强。此外，真菌网络的较低模块性可能会由于类群之间更高的交叉模块相关性而加剧不稳定效应。这些发现表明，由其较低的网络稳定性所示，真菌群落对FWD比细菌群落更敏感。之前的研究报告称，在干旱压力下，土壤细菌网络比真菌网络更不稳定。由于我们的样本是与植物相关的部位且外部压力是生物性的，这些可能解释了对比的结果。
我们的结果表明，取样地点对细菌群落的影响比对真菌群落更大。取样地点效应代表了每个地点的依赖于地点的环境特征（例如，气候和土壤类型）和该地点的栽培品种（宿主基因型）的交互效应，这些可能共同影响微生物群落的组成。细菌和真菌在体积、多样性、代谢活性、扩散潜力以及与宿主或其他微生物的互作中存在差异，这可能会影响物种排序和群落组装过程。
我们的数据表明，FWD减少了细菌网络的复杂性，但增加了真菌网络的复杂性。细菌和真菌网络之间的对比模式与基于土壤宏观生态学模式的枯萎病的最近观察相平行 。先前的研究揭示了网络复杂性和中心类群对支持生态系统功能的重要性。真菌的连通性，主要属于王国内部的合作互作，在患病的植物中增加，从而增强了真菌分类的生态重要性。此外，我们发现合作相关性在每个微生物王国内部都占主导地位，但细菌和真菌之间的竞争相关性占主导地位，这可能由于细菌和真菌通常竞争植物来源的底物。
疾病引发的微生物组成和功能变化
解密关键类群（例如，生物标记物种、核心类群和网络中心）及其与宿主植物和病原体的相关性，对于利用植物微生物组来增强植物生长和健康至关重要。在当前研究中，一些潜在的有益细菌，如假单胞菌（Pseudomonas）、链霉菌（Streptomyces）和芽孢杆菌（Bacillus），在患病的植物中被富集，这些细菌也被确定为植物微生物组的核心类群（即存在于所有样本中）。先前的研究显示，假单胞菌、链霉菌和芽孢杆菌属的许多成员殖民于不同的植物部位（例如，叶面和根际）并在调节宿主表现中起到至关重要的作用，尤其是在抑制植物病原体中。例如，链霉菌以分泌抗生素化合物而著称，并可保护植物免受病原体的侵害 。假单胞菌和芽孢杆菌是两种最主要的植物有益细菌，这两个属的一些代表性物种可以共存并与彼此合作。我们的结果显示，宿主植物可能会在病原体压力下选择性地调节一些核心类群的群落丰度。此外，诸如微杆菌（Microbacterium）、链霉菌和泛嗜菌（Pantoea）等多种细菌类群在患病的植物中被富集，并被确定为共生网络中的中心类群。中心类群在网络中占有关键的拓扑位置，可用于组织有利的植物微生物组。例如，关于拟南芥的研究表明，宿主植物通过调节叶面上的中心类群Albugo laibachii和Dioszegia spp.来选择性地影响其关联的微生物组和微生物-微生物互作。
生物标记物种、核心类群和网络中心之间的重叠表明，某些由患病植物招募的细菌类群可能作为植物微生物组的关键类群，确保下一代的生存。
本研究提供了证据，揭示了细菌分类群在植物的“求助”策略中的关键作用。在这种策略中，植物在外部压力下主动与其微生物伙伴合作，以最大化其或其后代的生存和生长。这是植物界中保留的一种生存策略。例如，一个关于甜菜根部腐病的研究表明，Chitinophagaceae和Flavobacteriaceae的成员在植物体内受到病原体入侵时会增加，并且Flavobacterium和Chitinophaga的合成社区可以持续抑制真菌根部疾病。几项最近的研究也建议上部病原体感染会引发根微生物组中有益于植物的细菌共生体的聚集。根据当前研究中提供的辣椒数据，与土传病原体（例如FWD）的感染驱使了有益微生物到宿主植物的地上部分。Liu等人提供了证据，证明了有益微生物被招募到小麦根圈和根内部，以抑制土传病原体Fusarium pseudograminearum。该研究还显示，当存在病原体时，有益的微生物Stenotrophomonas rhizophila可以增强植物在地上部分的防御。
宏基因组分析表明，与健康植物相比，患病植物中的微生物组功能基因丰富，这些基因涉及解毒、趋化性和生物膜形成。UDP-glucuronosyltransferases在患病辣椒的上茎表皮的微生物组中富集。这是生物膜形成途径的主要调节因子，它可以保护微生物免受不利的环境条件影响，从而增强微生物的生存。一些与植物-微生物信号途径相关的MCPs基因在患病根内部的微生物组中富集。MCPs是在运动的细菌中主导的化学感受器，它们在检测到特定化学物质后改变CheA组氨酸激酶的活性和细菌的游动行为。这些细菌将使用MCPs检测细胞外基质中这些分子的特定浓度，使细菌能够方向地积累到植物。尽管健康和患病辣椒微生物组的分类和功能分析为植物的“求助”策略提供了证据，但仍需要进行基于培养的实验来验证这一假设。尤其是，应分离丰富的可能有益的细菌，并在体内测试其抑制疾病的效果。在生物胁迫下释放的可能的植物信号分子也值得进一步探索。
最后，宏基因组分析显示FWD显著降低了上茎表皮微生物组的KO、COG和Resfam配置文件的功能多样性。功能多样性的降低很可能是由于微生物多样性的降低造成的。许多研究已经证明了生物多样性对生态系统功能的重要性。
结论：
基于所呈现的数据，宿主区室对细菌和真菌微生物组的组装产生最强的影响，其次是FWD，然后是采样地点。真菌群落对FWD的敏感性比细菌群落更高，真菌分类群在患病的相互作用王国网络中比健康网络起到更重要的作用。生殖部位的微生物组受FWD的影响较小，而植物营养部位的微生物组受影响较大。患病的辣椒植物的部位可能会招募有益的细菌分类群，这些细菌可以为宿主植物提供保护功能。当前的研究显著地增进了我们对辣椒在FWD下地下和地上部位微生物组组装和功能的理解，并为操纵植物微生物组以促进植物健康和可持续农业生产提供了可能性。
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图1. 辣椒细菌和真菌群落的组装。 a 辣椒植物的示意图，以及地下和地上的区室，包括土壤、根、茎和果实。 b 非度量多维缩放(NMDS)排序的Bray-Cutis差异矩阵与置换方差分析(PERMANOVA)，显示与细菌(左)和真菌(右)群落组成有显著关联的是，按重要性顺序，区室(R2 = 0.47 对于细菌和R2 = 0.53 对于真菌)、枯萎病(FWD, R2 = 0.06 和 0.03，分别)和采样地点(R2 = 0.01 和 0.02，分别)。 c 基于PERMANOVA，FWD和采样地点对单一区室中的细菌(左)和真菌(右)群落的变异的贡献。在大多数区室，FWD解释了真菌群落的更高变异，而不是细菌群落。 d Beta-分散性分析(基于Bray-Cutis差异)指示患病植物的细菌(左)和真菌(右)群落的不同性高于健康植物。 e-f 健康(红色)和患病(蓝色)植物的12个区室中的细菌和真菌群落的Shannon多样性指数。
图2. 火山图显示与健康器官相比，患病器官中的细菌和真菌微生物群的富集和耗竭模式。 a 枯萎病(FWD)对细菌ZOTUs丰度的影响（相对丰度 > 0.1%，共2549个）。符号对应于FWD富集的（正方形）和FWD减少的（三角形）ZOTUs。 b FWD对真菌ZOTUs丰度的影响（相对丰度 > 0.1%，共1030个）。请注意，功能行会信息在图S6b中提供。 c 患病植物中潜在有益细菌的相对丰度与健康植物相比显著增加（P < 0.001）。与健康器官相比，患病的根、茎和果实器官中潜在有益细菌的富集和消耗模式在图S6c中呈现。 d 患病植物中植物病原真菌的相对丰度与健康植物相比显著增加（P < 0.001）。最富集和最减少的分类群的分类信息在表S8和表S9中提供。 e 在患病植物中富集的几个细菌ZOTUs也被识别为健康和患病植物中的核心细菌分类群。 f 在患病植物中富集的几个真菌ZOTUs也被识别为健康和患病植物中的核心真菌分类群。
图3. 同界共现网络。 a 显示细菌网络的节点和边数高于真菌网络的同界共现网络。节点根据细菌门和真菌纲进行上色。节点大小表示连接的程度。边的颜色代表正向（绿色）和负向（红色）的相关性。 b 比较图3a中节点级的拓扑特性（度和接近中心性），展示了枢纽分类群的高度和接近中心性。枢纽分类群的分类信息在表S12中给出。 c 四个网络中前10个枢纽节点的度和交互类型，显示细菌网络中负相关的数量多于真菌网络。细菌和真菌分类群的度（d）和边（e）显示健康细菌网络的复杂性高于患病细菌网络，而真菌网络显示出相反的模式。差异的显著性由非参数Kruskal-Wallis检验确定。
图4. 跨界共现网络。 a 含有细菌和真菌分类群的网络显示，在患病网络中真菌分类群（橙色）的数量增多，而细菌分类群（蓝色）的数量减少，与健康网络相比。土壤、根、茎（上、中、下）和果实的网络在图S12中展示。 b 比较图4a中节点级的拓扑特性（度和接近中心性），展示了枢纽分类群的高度和接近中心性值。枢纽分类群的分类信息在表S12中提供。 c 健康和患病网络中细菌和真菌分类群的度值。差异的显著性由非参数Kruskal-Wallis检验确定。 d 健康和患病网络中的细菌-细菌（BB）、细菌-真菌（BF）和真菌-真菌（FF）相关性数量。边和列的绿色和红色分别表示正向和负向相关。 e 健康（左）和患病（右）网络中前10个枢纽节点的度和交互类型。“同界相关”指的是BB或FF，“跨界相关”指的是BF。
图5. 基于KO、COG、CAZ和ResFam功能分析的植物微生物组功能多样性和健康与患病植物间功能基因/模块的差异丰度。 a 通过宏基因组数据分析确定，与健康植物相比，患病植物中有益细菌的丰富度和消耗度。其中"Rendo"代表根部内生区，"US-epidermis"代表上部茎表皮。 b 通过宏基因组数据分析确定，与健康植物相比，患病植物中潜在病原真菌的丰富度和消耗度。 c 基于KO、CAZ和ResFam功能基因的Bray-Curtis距离矩阵的NMDS排序显示，患病的上茎表皮微生物组与健康植物显著不同。在根部内生区的微生物组中没有这样显著的差异（如图S14a所示）。 d FWD显著降低了上部茎表皮微生物组中的KO (P = 0.0314)、COG (P = 0.0074)和Resfam (P = 0.0065)的功能多样性，但对根部内生区的微生物组没有显著效应（P > 0.05）。 e 健康（红色）和患病（蓝色）植物之间的微生物组功能基因的差异丰富度分析。 f 根部内生区中涉及甲基接受趋化蛋白及其下游目标的微生物组功能基因的相对丰度。
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