测序数据质控软件

标签：-- 测序 reads 接头 序列 软件 质控

测序数据质控是高通量测序（Next-Generation Sequencing, NGS）流程中的重要环节。测序数据的质量直接影响下游分析结果的准确性，因此在分析之前，必须对原始数据进行质控，确保数据可靠。

测序数据质控的目标

1. 去除低质量数据：过滤掉碱基质量较差的reads，减少噪音。

2. 去除接头序列：避免接头污染影响对目标序列的分析。

3. 去除污染数据：排除如宿主DNA、微生物或其他非目标物质的污染。

4. 保留足够长的序列：确保序列长度适合后续比对或组装。

5. 生成质量报告：检测数据的整体质量，确定是否需要进行进一步修剪。

常用质控工具

1. FastQC：生成可视化的质量报告，帮助用户识别质量问题。

2. Cutadapt：去除测序接头序列，并修剪末端低质量碱基。

3. Trimmomatic：适用于双端测序数据的全面修剪工具。

4. Fastp：快速、全能的质控工具，支持接头去除和报告生成。

5. SOAPnuke：华大基因开发的工具，适合大规模基因组和转录组数据处理。

质控的重要性

• 提高比对效率：去除低质量数据后，剩余reads更容易准确比对到参考基因组。

• 减少下游分析误差：避免因低质量或污染数据导致的假阳性或假阴性结果。

• 确保数据可重复性：高质量数据可以提高分析的稳定性和重现性。

质控在不同应用中的需求

• 基因组测序：更注重去除污染和保留高质量的长reads。

• RNA-Seq：需要去除接头和 polyA/polyG 序列，并检测是否存在 rRNA 污染。

• 单细胞测序：由于数据量较大且噪声较高，对数据质控要求更高，通常需要特别处理 polyG 序列和低质量片段。

以下是 Cutadapt, Trimmomatic, Fastp, FastQC 和 SOAPnuke 这五款测序数据质控软件的简介，包括它们的主要特点和适用场景。

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1. Cutadapt

Cutadapt 是一个专门用于去除测序数据中接头序列的工具。它广泛应用于高通量测序数据的预处理，尤其适合单端和双端测序。

主要特点：

• 接头去除：支持自定义接头序列。

• 质量过滤：能去除低质量碱基。

• 多种格式支持：支持单端、双端测序数据以及 gzipped 文件。

适用场景：

• 用于测序文库污染（接头序列残留）的处理。

• RNA-Seq 或基因组测序的基础数据清理。

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2. Trimmomatic

Trimmomatic 是一个灵活且广泛应用的工具，特别适合处理双端测序数据。它可以有效地修剪接头序列和低质量片段，并保持配对数据的完整性。

主要特点：

• 滑动窗口质控：动态检查reads质量，低质量部分被剪除。

• 双端处理：输入、输出支持配对reads，并自动同步配对信息。

• 多参数灵活修剪：如 LEADING、TRAILING、MINLEN 等，用户可以细化控制。

适用场景：

• 适合较大规模的双端测序数据。

• 在基因组、RNA-Seq 和转录组数据分析中常用。

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3. Fastp

Fastp 是一个新一代快速、全能的质控工具，集成了常见的接头去除和数据过滤功能，并支持生成HTML报告。

主要特点：

• 自动识别接头序列：减少手动设置的复杂性。

• 质控报告生成：提供HTML和JSON格式的报告。

• 多线程支持：速度快，适合大规模数据处理。

• 特化功能：支持去除 polyG 序列（常见于单细胞 RNA-Seq 数据）。

适用场景：

• 适用于需要高效批量处理的项目，如单细胞测序和RNA-Seq分析【17】。

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4. FastQC

FastQC 是一个用于生成测序数据质量报告的工具。虽然它不执行实际的修剪操作，但通过检测序列质量和接头污染来帮助用户优化数据。

主要特点：

• 质量评估：生成包括每个位点的碱基质量、GC 含量、接头污染的报告。

• 可视化：提供丰富的图形报告，便于发现潜在问题。

• 简单易用：适用于任何类型的测序数据。

适用场景：

• 快速评估测序数据的整体质量，发现异常或污染。

• 作为质控流程的第一步，用于决定后续的修剪策略。

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5. SOAPnuke

SOAPnuke 是华大基因开发的一款高效质控工具，特别适合大规模数据处理。它集成了接头去除、低质量过滤和质量报告生成等功能。

主要特点：

• 多线程处理：加速大规模数据处理。

• 接头去除和低质量过滤：支持灵活的接头匹配和序列清理。

• 适合多类型数据：支持 RNA-Seq 和基因组测序数据。

适用场景：

• 适合大规模基因组项目和多样品分析。

• 可作为华大基因测序项目的标准质控流程的一部分。

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总结

• Cutadapt 和 Trimmomatic 更专注于接头去除和修剪，适合特定的高质量数据预处理。

• Fastp 提供了更全面且快速的质控功能，适合处理大量样品。

• FastQC 是一个质量检查工具，用于检测和分析数据中的潜在问题。

• SOAPnuke 适合大规模数据的多线程处理，特别适用于复杂项目。

这些工具可以结合使用，如先使用 FastQC 检查数据，再用 Cutadapt 或 Trimmomatic 进行修剪，最后用 Fastp 或 SOAPnuke 完成过滤与报告生成。

以下是如何安装 Cutadapt, Trimmomatic, Fastp, FastQC 和 SOAPnuke 的方法。这些工具在不同操作系统上有些差异，主要支持 Linux/macOS 环境，有些也支持 Windows。

1. Cutadapt 安装

方法 1：通过 pip 安装（推荐）

pip install cutadapt

• 依赖：需要 Python 3.6 以上版本。

• 安装完成后，可以用 cutadapt --version 检查版本。

方法 2：从源码安装

1. 下载源码：https://github.com/marcelm/cutadapt

2. 解压并进入目录后执行：

   python setup.py install

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2. Trimmomatic 安装

步骤：

1. 从官方网站或 GitHub 下载 JAR 文件：Trimmomatic GitHub。

2. 将下载的 JAR 文件放入某个目录，如 /path/to/trimmomatic/。

运行：

java -jar /path/to/trimmomatic/trimmomatic-0.39.jar

• 依赖：需要 Java 8 或以上版本。

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3. Fastp 安装

方法 1：通过 conda 安装

conda install -c bioconda fastp

方法 2：从源码安装

克隆 GitHub 项目：

git clone https://github.com/OpenGene/fastp.git

进入目录后编译：

cd fastp
make

测试：

./fastp --version

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4. FastQC 安装

方法 1：下载压缩包

1. 从官方网站下载：https://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/。

2. 解压缩后进入目录：

unzip fastqc_v*.zip
cd FastQC

运行：

./fastqc --help

• 依赖：需要 Java 8 或更高版本。

方法 2：通过 conda 安装

conda install -c bioconda fastqc

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5. SOAPnuke 安装

1. 从 GitHub 克隆项目：https://github.com/BGI-flexlab/SOAPnuke。

2. 安装依赖并编译：

git clone https://github.com/BGI-flexlab/SOAPnuke.git
cd SOAPnuke
make

将 SOAPnuke 二进制文件添加到系统路径中：

export PATH=$PATH:/path/to/SOAPnuke/

测试：

SOAPnuke filter --help

以下是 Cutadapt, Trimmomatic, Fastp ， FastQC ，SOAPnuke 测序数据质控工具的详细参数解读：

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1. Cutadapt

Cutadapt 是一个常用于去除接头序列和修剪低质量数据的工具。
常见参数：

• -a/--adapter：指定需要去除的接头序列（正向）。

• -A/--adapter：用于双端测序，指定反向接头序列。

• -q/--quality-cutoff：设定质量修剪阈值，过滤掉低于该值的碱基。

• --minimum-length：设定reads的最小长度，短于该长度的reads会被丢弃。

• -m/--overlap：设定检测接头序列的最小重叠长度。

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2. Trimmomatic

Trimmomatic 是一个灵活的修剪工具，适合双端和单端测序数据。
常用参数：

• ILLUMINACLIP：指定接头序列文件并设置剪切阈值和容忍参数。

• LEADING/TRAILING：去除reads两端的低质量碱基，指定最小质量值。

• SLIDINGWINDOW：使用滑动窗口计算窗口内碱基平均质量，若低于阈值则截断。

• MINLEN：设定最小reads长度，长度不满足要求的会被丢弃。

• CROP/HEADCROP：直接截取序列的末端或开头的一定数量碱基。

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3. Fastp

Fastp 是一个快速全能的质控工具，集成了修剪、过滤和质量评估功能。
关键参数：

• -q：设定最小的碱基质量值。

• --cut_right/--cut_tail：去除reads末端的低质量片段。

• --adapter_sequence：指定接头序列用于修剪。

• --length_required：设定保留的最小序列长度。

• --trim_poly_g/A/T：自动识别并去除polyG/polyA序列（常见于单细胞测序数据）。

• --html/--json：生成质控报告，以HTML或JSON格式输出。

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4. FastQC

FastQC 用于生成测序数据的质量报告。
重要指标和参数：

• Basic Statistics：展示文件名、序列总数、GC含量等基本信息。

• Per Base Sequence Quality：分析每个位点的碱基质量。

• Per Sequence GC Content：统计每个序列的GC含量并检测偏差。

• Adapter Content：检测接头序列污染情况。

• Overrepresented Sequences：检测过表达序列的比例并标记可疑的reads。

SOAPnuke 是华大基因开发的一款高效、支持多线程的测序数据质控软件，专门用于处理高通量测序数据。它支持多种测序类型（如RNA-Seq、基因组测序等），并能够进行接头去除、低质量reads过滤等操作。

SOAPnuke 常用参数解读

1. 基本输入和输出参数：

   • -1：指定正向（R1）reads的输入文件路径。

   • -2：指定反向（R2）reads的输入文件路径。

   • -o：指定输出目录，质控后的数据将输出到该目录下。

2. 过滤参数：

   • -f：保留高质量的reads，即保留reads中碱基质量值大于某个设定值的片段（默认值为20）。

   • -q：设定低质量碱基的最小质量阈值，低于该值的碱基将被过滤。

   • -n：设置序列中允许的最大 N 碱基个数。超过这个数值的reads将被丢弃。

3. 接头去除参数：

   • -a：指定正向reads的接头序列，用于去除接头污染。

   • -A：指定反向reads的接头序列。

4. 多线程处理：

   • -l：设定使用的线程数，用于加速处理大规模数据。

5. 其他选项：

   • -b：指定 BAM/CRAM 格式的输入文件，而不仅仅是FASTQ文件。

   • -c：启用压缩输出，通常用于节省存储空间。

6. 数据修剪和过滤：

   • -r：对每个 read 进行修剪，以去除质量较差的末端碱基。

   • -M：指定 reads 的最小长度。修剪后的 reads 如果短于该长度将被丢弃。

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这些工具适用于不同场景：

• Cutadapt 适合接头序列修剪。

• Trimmomatic 更灵活且适合双端数据。

• Fastp 整合多种质控功能，性能高效。

• FastQC 主要用于质控报告生成，帮助识别问题数据。

根据具体的项目需求，可以组合使用这些工具，以确保数据质量达标并提升下游分析的准确性。

下面是 Cutadapt, Trimmomatic, Fastp ， FastQC ，SOAPnuke 

的示例命令：

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1. Cutadapt 示例命令

目标：去除接头序列，并过滤掉长度小于 30bp 的 reads。

cutadapt -a AGATCGGAAGAG -A AGATCGGAAGAG \-m 30 -q 20,20 \-o output_R1.fastq -p output_R2.fastq input_R1.fastq input_R2.fastq
-a / -A：指定正向和反向接头序列。
-m 30：保留长度不小于 30bp 的 reads。
-q 20,20：对每个read的两端都要求质量值不低于 20。

2. Trimmomatic 示例命令

目标：双端测序数据的接头去除和低质量片段修剪。

java -jar trimmomatic-0.39.jar PE -phred33 \input_R1.fastq input_R2.fastq \output_R1_paired.fastq output_R1_unpaired.fastq \output_R2_paired.fastq output_R2_unpaired.fastq \ILLUMINACLIP:adapters.fa:2:30:10 \LEADING:20 TRAILING:20 SLIDINGWINDOW:4:15 MINLEN:36
ILLUMINACLIP：使用接头文件 adapters.fa 进行匹配。
LEADING/TRAILING：修剪两端质量值小于 20 的碱基。
SLIDINGWINDOW：滑动窗口内平均质量值低于 15 则截断。
MINLEN：保留长度不小于 36bp 的 reads。

3. Fastp 示例命令

目标：对单端测序数据进行接头去除和质量过滤，并生成HTML报告。

fastp -i input.fastq -o output.fastq \--adapter_sequence=AGATCGGAAGAG \--trim_poly_g --length_required=30 --cut_right=20 \--html report.html --json report.json
--adapter_sequence：指定接头序列。
--trim_poly_g：去除 polyG 序列。
--cut_right：从序列末端去除质量值低于 20 的碱基。
--html / --json：生成质控报告。

4. FastQC 示例命令

目标：对输入的FASTQ文件生成质量报告。

fastqc input.fastq -o ./qc_reports/ --threads 4
-o：指定输出目录。
--threads：设置使用的线程数，以加快分析速度。

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这些示例命令可根据具体需求进行调整。通常情况下，这些工具可以结合使用，例如：先用 Cutadapt 或 Trimmomatic 进行接头和质量修剪，再用 FastQC 检查质控效果，最后用 Fastp 完成剩余过滤与报告生成。

5.SOAPnuke 示例命令

目标：对双端测序数据进行接头去除、低质量过滤，设置最小长度为 36bp，并使用多线程加速。

SOAPnuke filter -1 input_R1.fastq -2 input_R2.fastq \-o ./output_directory \-f 20 -q 0.1 -n 0.02 -l 8 -r -M 36 \-a AGATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCAC -A AGATCGGAAGAGCGTCGTGTAGGGAAAGAGTGTA \-b
filter：指定进行质控过滤操作。
-1 和 -2：指定输入文件为 R1 和 R2。
-o：设定质控后的输出目录。
-f 20：设定高质量碱基的最小阈值为 20。
-q 0.1：允许低于阈值的碱基比例为 10%。
-n 0.02：序列中允许的最大 N 碱基比例为 2%。
-l 8：使用 8 个线程进行处理。
-r：去除低质量的末端碱基。
-M 36：修剪后保留长度大于 36bp 的 reads。
-a 和 -A：指定正向和反向接头序列。
-b：启用 BAM 格式的输入文件处理。

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