A visual method to detect meat adulteration by recombinase polymerase amplification combined with l

创新点：基于重组酶聚合酶扩增（RPA）和侧向流试纸（LFD）的视觉方法，用于鉴定牛肉（Bos taurus）、绵羊（Ovis aries）、猪肉（Sus scrofa）、鸭肉（Anas platyrhynchos）和鸡肉（Gallus gallus）的动物来源。传统的方法需要操作员具备相当的技能、昂贵的仪器，并且无法提供快速的移动式现场检测系统来检测肉制品的污染情况。而这种新方法通过肉质量反应，可以在20分钟内完成。结果可以用肉眼来判断。该方法的RPA-LFD检测限为鸭肉、牛肉、绵羊肉、鸡肉和猪肉分别为101/µL、102/µL、102/µL、101/µL和101/µL。此外，RPA-LFD检测方法可以区分煮熟、微波、压力烹饪或油炸样品中的物种。这些RPA-LFD检测方法代表了一种快速、移动的检测系统，用于确定肉制品的污染情况。

背景：重组酶聚合酶扩增（RPA）是一种由TwistDX（英国剑桥）开发的新型等温扩增方法（Piepenburg, Williams, Stemple, & Armes, 2006），由于其高灵敏度和快速性，已在检测中显示出巨大优势。此外，RPA在资源匮乏的实验室和户外不需要复杂的仪器，适用于样品的快速现场测试，这通常是传统分子方法所无法实现的。该方法使用两个特异性的寡核苷酸引物，结合重组酶的帮助与链位移DNA合成结合到模板DNA上。在略高于室温的温度下，复杂DNA目标的扩增可以在不到30分钟内完成。RPA产物可以通过凝胶电泳（Cao et al., 2018）或探针基础的荧光监测（Geng et al., 2019; Kissenk¨otter et al., 2020），或者简单地通过核酸侧向流免疫测定（Fu, Zhang, Zhou, & Liu, 2020; Li et al., 2019）进行可视化检测。

方法：

1 样品的准备和DNA提取过程：首先，肉类样品（牛肉、羊肉、猪肉、鸭肉和鸡肉）从当地超市购买，并使用无菌手术刀将其切成小块，然后在使用前存储在-20°C。接下来，使用基因组DNA（gDNA）提取试剂盒（TIANGEN，中国北京）提取5毫克样品的gDNA。提取的DNA的数量和质量通过NanoDrop™ ND-2000分光光度计（Thermo Scientific，美国）确定，并随后在-80°C存储以备使用。

2RPA引物和LFD探针的设计：首先从国家生物技术信息中心（NCBI）获取了目标物种（绵羊、牛、猪、鸡和鸭）的线粒体基因组序列。然后，使用在线的基本局部比对算法搜索工具（BLAST）对候选序列进行了同源性分析，以确保它们与其他物种的同源性（即，特异性）。

接着，根据TwistAmp® nfo反应试剂盒说明书的指导，使用Primer Premier 5.0软件设计了RPA引物和LFD探针。这些引物和探针由杭州青科紫熙生物技术有限公司合成。设计过程中，每个反向引物的5'端标记有异硫氰酸荧光素（FITC），每个探针的5'端标记有生物素。探针的3'端附有磷酸化阻断剂，以防止在扩增过程中的核酸聚合。此外，在探针序列中引入了一个dSpacer四氢呋喃（THF）插入物，以模拟碱性位点。

综上所述，这些设计考虑了引物和探针的特定标记和修饰，以确保其在RPA和LFD反应中的高效性和特异性。

注意：

A：将反向引物的5'端标记为异硫氰酸荧光素（FITC），以及将探针的5'端标记为生物素，具有以下目的：

1. 标记引物和探针：通过在引物和探针上标记不同的化学物质，可以使它们在实验中具有可检测的性质。FITC和生物素都是常用的标记物，它们可以方便地与其他化合物反应或被检测。

2. 实现信号检测：FITC和生物素标记允许使用相应的检测方法来检测引物和探针的存在。例如，FITC标记的引物可以通过荧光检测来确定扩增反应的进行情况，而生物素标记的探针可以与其他物质（如荧光素-链霉亲和素）结合，并通过荧光信号或免疫检测方法来检测。

3. 实现多重检测：生物素和FITC的标记使得引物和探针可以在同一实验中进行多重检测，从而提高实验的灵敏度和特异性。通过适当的检测方法，可以同时监测不同的标记物，从而实现对目标序列的准确检测和定量。

B：将磷酸化阻断物附着到探针的3'端，并在探针序列中引入dSpacer四氢呋喃（THF）有两个主要目的：

1. 阻止核苷酸聚合：磷酸化阻断物的加入可以有效地防止在扩增过程中探针的3'端与游离的核苷酸聚合。这种阻断物可以防止新的核苷酸链在探针的3'端继续延伸，从而确保扩增过程中探针的稳定性和特异性。

2. 模拟基本位点：将dSpacer THF引入到探针序列中，目的是模拟一个基本位点。基本位点是DNA或RNA链中缺少核苷酸的部位，其存在可以模拟单链断裂的情况。在探针序列中引入dSpacer THF可以使探针在特定条件下形成一个类似于基本位点的结构，从而促进CRISPR/Cas12a的识别和切割作用，提高检测的特异性和灵敏度。

3横向流动试纸（Lateral Flow Dipstick Assay）是一种基于横向流动技术和金颗粒的成熟、即用型的测试工具。该技术常用于快速检测样本中特定目标物质的存在与否。下面是该技术的工作原理和步骤：

1. 基本原理：横向流动试纸利用特定抗体与待检测物质结合的原理进行检测。在试纸上有两条线，一条是控制线（Control Line，C），用于确认试纸是否正常工作；另一条是测试线（Test Line，T），用于检测待测物质的存在。

2. 操作步骤：

   • 样品处理：将待检测的样品（例如RPA产物）与适量的稀释剂混合，以便在试纸上进行检测。
   • 加样：将处理好的样品滴加到试纸的样品入口处。
   • 观察结果：在室温下，待检测的样品会通过试纸，金颗粒标记的抗体将与目标物质结合（如果存在）。在约2-4分钟内，如果样品中存在目标物质，则会在测试线处出现颜色条带；如果样品中不存在目标物质，则只会在控制线处出现颜色条带。
   • 结果判读：根据测试线和控制线的出现情况来判断样品中目标物质的存在与否。

4 在RPA-LFD（重组聚合酶扩增 - 横向流动试纸检测）方法中，对其特异性和敏感性进行评估是非常重要的。下面是对这两个方面的解释：

1. 特异性（Specificity）：特异性是指检测方法对目标物质的选择性。在这个研究中，特异性评估通过使用五种不同肉类（Bos taurus、Ovis aries、Sus scrofa、Gallus gallus和Anas platyrhynchos）的基因组DNA（gDNA）和质粒进行。质粒包含了整个RPA和五种肉类的目标片段。这些肉类的基因组DNA和质粒被用来评估RPA-LFD方法是否能够准确识别目标DNA序列，而不受其他DNA的干扰。

2. 敏感性（Sensitivity）：敏感性是指检测方法对目标物质的检测能力。在这个研究中，敏感性评估通过定量和稀释包含目标片段的质粒来进行。通过使用NanoDrop™ ND-2000分光光度计测量质粒的DNA浓度，然后根据一定的计算公式计算质粒的拷贝数。接着，对这些质粒进行十倍系列稀释，以获得从1 × 10^6到1个拷贝/μL的标准质粒DNA梯度。通过这样的稀释，评估了RPA-LFD方法在不同DNA浓度下的检测能力

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描述了RPA-LFD（Recombinase Polymerase Amplification - Lateral Flow Dipstick）检测方法与多重PCR（Multiplex Polymerase Chain Reaction）检测方法之间的比较。

1. 实验设计：实验中选择了真实样本和人为掺假样本进行盲测。样本被重新编码，然后分别使用RPA-LFD方法和多重PCR方法进行分析。

2. 多重PCR方法：多重PCR用于同时识别五种不同的动物（绵羊、牛肉、猪肉、鸭肉和鸡肉）。在实验中，使用了特定的引物序列，这些引物能够同时放大目标DNA片段。PCR反应混合物中包括待检测的基因组DNA、PCR Mix和引物。随后，进行一系列的温度循环，以使目标DNA片段进行放大。最后，将PCR产物电泳分离，并在含有GeneGreen染料的琼脂糖凝胶上进行可视化。

3. RPA-LFD方法：RPA-LFD方法利用重组酶的引物放大目标DNA片段，并使用横向流动试纸（LFD）进行检测。实验中使用了特定的引物和LFD试纸来识别五种不同动物的DNA。放大的DNA样品与试纸反应后，如果样品中存在目标DNA片段，则在试纸上会显示出对应的条带。这种方法快速、简便，并且结果可通过肉眼直接观察。

4. 比较：对比RPA-LFD方法和多重PCR方法的效果，包括检测的准确性、灵敏度和特异性。这种比较有助于评估两种方法在检测肉类样品中目标DNA的能力，从而确定哪种方法更适合特定的应用场景。