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卵巢癌（Ovarian cancer，OC）是影响女性生殖系统的三种常见恶性肿瘤之一。转录因子Forkhead box蛋白O1（FoxO1），又称forkhead横纹肌肉瘤（rhabdomyosarcoma）转录因子，属于Forkhead box O（FoxO）转录因子家族，处于肿瘤分子调控网络的中心。大量研究表明，FoxO1失衡与肿瘤发展、侵袭和转移的病理过程密切相关。然而，关于FoxO1在OC中的作用没有统一的结论。
2024年2月25日，医药生物技术国家重点实验室（南京大学）窦环博士团队以“FoxO1 promotes ovarian cancer by increasing transcription and METTL14-mediated m6A modification of SMC4”为题在《Cancer Science》杂志发表研究论文，讨论了FoxO1在OC中的作用和分子机制，表明了FoxO1驱动的4号染色体结构维持（structural maintenance of chromosome 4，SMC4）表达对OC发生至关重要，本研究可能为OC患者的早期诊断和靶向治疗提供重要启示。
标题：FoxO1 promotes ovarian cancer by increasing transcription and METTL14-mediated m6A modification of SMC4（FoxO1增加SMC4转录和METTL14介导m6A修饰以促进卵巢癌发展）
时间：2024-2-25
期刊：Cancer Science
影响因子：IF 5.7
技术平台：ChIP-seq等
研究摘要
转录因子FoxO1与卵巢癌（OC）发生发展密切相关，但其作用和分子机制尚不清楚。本研究分析结果解释了FoxO1在OC患者的临床样本中高表达，且与预后不良显著相关。FoxO1敲低在体外和体内抑制OC细胞增殖。ChIP-seq结合GEPIA2和Kaplan-Meier数据库分析表明，4号染色体的结构维持（SMC4）是FoxO1的下游靶标，FoxO1通过与其-1400/-1390 bp启动子结合来促进SMC4转录。SMC4高表达显著阻断了FoxO1敲低的肿瘤抑制作用。此外，FoxO1通过转录激活甲基转移酶样14（METTL14）并增加其编码序列区域上的SMC4 m6A甲基化来增加SMC4 mRNA丰度。癌症基因组图谱（TCGA）数据集分析证实了OC中FoxO1、SMC4和METTL14表达之间存在显著正相关。总之，这项研究揭示了FoxO1调控SMC4的分子机制，并在OC发生过程中FoxO1/METTL14/SMC4的表达之间建立了临床联系，从而提供了潜在的诊断靶点和治疗策略。
研究结果
（1）卵巢癌（OC）中FoxO1过表达与预后不良相关。
图1：FoxO1在OC组织中上调，FoxO1的高表达与预后不良有关。
（A）FoxO1基因在GSE18520的OC和正常卵巢组织中的表达水平。
（B）IHC检测到34例OC组织和邻近正常对照组织中FoxO1表达的代表性图像。
（C-D） FoxO1染色强度（C）和定量分析（D）的代表性图像。
（E）使用Kaplan–Meier数据库分析了TCGA和GEO数据集中OC患者的OS和PFS。
表1：OC患者FOXO1蛋白水平与临床病理特征的关系。
（2）FoxO1在体外促进OC细胞增殖、迁移和侵袭
图2：FoxO1过表达促进体外OC细胞的增殖、迁移和侵袭并抑制其凋亡。
（A-B） 用FoxO1过表达质粒或空载体转染的OC细胞系中FoxO1 mRNA和蛋白质表达的比较。
（C） 使用CCK-8法分析细胞活力。
（D） 通过菌落形成实验确定的菌落的代表性图像。
（E–H） 通过流式细胞术检测EdU（E）、细胞周期（F）和凋亡（H）检测到的细胞增殖；（G）western blot检测G1/S期标记蛋白。
（I） 划痕愈合实验检测细胞迁移。比例尺=400μm。
（J-K） 通过transwell检测细胞迁移（J）和侵袭（K）能力。比例尺=200μm。
图3：FoxO1沉默在体外抑制OC细胞的增殖、迁移和侵袭并促进其凋亡。
（A-B） 用siFoxO1或siNC转染的OC细胞系中FoxO1 mRNA和蛋白质表达的比较。
（C） 使用CCK-8测定法分析细胞活力。
（D） 通过菌落形成实验确定的菌落的代表性图像。
（E–H） 通过流式细胞术测定EdU（E）、细胞周期（F）和凋亡（H）检测到的细胞增殖；（G）western blot检测G1/S期标记蛋白。
（I） 划痕愈合实验检测细胞迁移。比例尺=400μm。
（J-K） 通过transwell检测细胞迁移（J）和侵袭（K）能力。比例尺=200μm。
（3）敲低FoxO1抑制体内OC肿瘤发生
图4：FoxO1的敲低抑制了C57BL/6小鼠中ID8衍生的原位异种移植物的生长。将稳定转染shNC或靶向FoxO1的shRNA的ID8细胞皮下注射到C57BL/6小鼠的背侧（n=6）。
（A-B） 通过RT-qPCR和western blot验证慢病毒产生稳定FoxO1敲低细胞系。
（C-E） （C）肿瘤结节、（D）肿瘤重量和（E）小鼠异种移植物肿瘤体积的生长曲线。
（F） 小动物的活体成像检测异种移植肿瘤的荧光强度。
（G） IHC检测shNC和shFoxO1肿瘤组织中Ki-67的表达。
4、SMC4受FoxO1转录调控
图5：FoxO1直接激活OC中的SMC4转录。
（A） OC中FoxO1下游靶标的筛选策略图。
（B） 使用GEPIA2数据库分析了OC和正常卵巢组织样品之间DEG的火山图。
（C） DEG的GO富集分析（列出了前20位）。
（D） ChIP-seq分析ID8细胞中FoxO1结合序列在DNA长度上的分布。
（E） FoxO1结合启动子区域中基因的维恩图以及细胞迁移、增殖和周期的DEG。
（F） RT-qPCR检测FoxO1的36个潜在结合靶标的表达，并稳定敲低FoxO1及其对照细胞。
（G-H） 在FoxO1的高表达或敲低后检测到SMC4的mRNA和蛋白质水平。
（I） FoxO1与SMC4启动子序列结合的IGV图。
（J） JASPAR数据库预测了SMC4启动子区域中潜在的FoxO1结合位点和motif。
（K） ChIP-qPCR验证SMC4启动子处FoxO1的富集水平。
（L） SMC4启动子荧光素酶报告基因示意图。
（M） 转染FoxO1过表达或对照质粒后，检测到SMC4-WT、SMC4-MUT或SMC4-TRU结合位点的荧光素酶活性。
（N） 转染FoxO1过表达或稳定敲低FoxO1及其对照ID8细胞的对照质粒后，检测到具有WT结合位点的荧光素酶活性。
（5）SMC4介导FoxO1加重体内OC恶性表型
图6：SMC4促进ID8细胞的增殖、迁移和侵袭，并抑制其凋亡，是FoxO1促进卵巢癌（OC）过程中的关键分子。
(A-B) 在GEO数据集中比较OC组织与正常上皮组织中SMC4的表达水平。
(C-D) 使用Kaplan–Meier数据库分析TCGA和GSE9891数据集中OC患者的总生存期（OS）和无进展生存期（PFS）。
(E-F) 检测转染SMC4高表达质粒或siSMC4后的SMC4 mRNA和蛋白水平。
(G) 使用CCK-8实验分析细胞活力。
(H) 通过集落形成实验确定的代表性图像。
(I–L) 通过流式细胞仪检测EdU标记的细胞增殖（I）、细胞周期（J）和凋亡（L）；
(K) 通过western blot检测G1/S期标记蛋白。
(M) 使用划痕愈合实验检测细胞迁移。比例尺= 400μm。
(N) 通过Transwell实验检测细胞迁移和侵袭能力。比例尺= 200μm。
(O) 通过western blot检测TGF-β/Smad和JAK2/STAT3通路分子的蛋白表达变化。将稳定转染了shNC或针对FoxO1的shRNA的ID8细胞皮下注射到C57BL/6小鼠的背部侧翼（n = 6），并在肿瘤内注射高表达SMC4的慢病毒或对照病毒。
(P) 在肿瘤中检测SMC4的蛋白表达水平。
(Q-S) 小鼠异种移植物的肿瘤结节(Q)、肿瘤重量(R)以及肿瘤体积(S)生长曲线。
(6) FoxO1通过METTL14介导的m6A修饰促进SMC4 mRNA的稳定性
图 7：FoxO1通过调调控METTL14介导的m6A修饰来促进SMC4表达。
- 在用放线菌素D（5微克/毫升）处理0、3或6小时后，使用RT-qPCR分析FoxO1低表达对ID8细胞中SMC4 mRNA半衰期的影响。
- 在FoxO1高表达后，检测m6A修饰关键调控基因的mRNA水平。
- 在FoxO1高表达后，检测m6A修饰关键调控基因的蛋白水平。
- 使用Kaplan–Meier数据库分析GSE30161数据集中OC患者的总生存期（OS）和无进展生存期（PFS）。
(E-F) 在转染高表达METTL14质粒或siMETTL14后，检测METTL14和SMC4的mRNA和蛋白水平变化。
(G) 使用Western blot检测在敲低FoxO1后高表达METTL14对METTL14和SMC4蛋白水平的影响。
(H) 使用METTL14-RIP-qPCR检测FoxO1敲低后SMC4 mRNA的富集情况。
- SRAMP数据库中SMC4 mRNA的预测结果显示m6A修饰的潜在位点。红色箭头指向高置信度位点。
(J) 使用MeRIP-qPCR检测在METTL14低表达后SMC4 mRNA预测结合位点的富集情况。
(K) 使用RT-qPCR分析METTL14高或低表达对SMC4 mRNA半衰期的影响。
(L) 在ID8细胞中转染含有RNA甲基化编辑器和gRNA或非靶向gRNA（NT-gRNA）的慢病毒后，通过RT-qPCR检测SMC4 mRNA的半衰期。
(M) 在ID8细胞中转染含有RNA甲基化编辑器和gRNA或NT-gRNA的慢病毒后，检测SMC4 mRNA和蛋白的表达。
(N) 在ID8中敲低FoxO1后，使用MeRIP-qPCR检测SMC4 mRNA预测结合位点的富集情况。
(O) 使用ChIP-qPCR鉴定FoxO1在METTL14启动子的富集水平。
(P) 在转染FoxO1过表达或对照质粒后，检测METTL14-WT、METTL14-MUT结合位点的荧光素酶活性。
（7）OC中FoxO1、SMC4和METTL14的表达呈正相关
图8：在临床样本和小鼠模型中，FoxO1、SMC4和METTL14在卵巢癌（OC）中的相关性分析。
- 散点图显示了来自TCGA的376名OC患者OC组织中FoxO1、SMC4和METTL14 mRNA的相关性。
- 使用斯皮尔曼相关性分析检测了12只小鼠异种移植物中FoxO1、SMC4和METTL14 mRNA水平之间的相关性。
- 工作模型展示了通过转录激活和增加METTL14介导的m6A修饰来调控SMC4，从而促进OC的发展。
研究小结：
本研究揭示了FoxO1在卵巢癌（OC）中的致癌作用，以及FoxO1在SMC4的转录激活和METTL4介导的m6A修饰机制。FoxO1可以直接与SMC4启动子结合，以促进SMC4的翻译，此外，FoxO1还可以直接与METTL14启动子结合，并通过m6A METTL14依赖性方式促进SMC4的稳定性，从而促进OC细胞的增殖、迁移和侵袭（图8C）。这些发现表明，FoxO1/METTL14/SMC4轴是诊断和治疗OC的一个有前景的因素。
关于易基因染色质免疫共沉淀测序 (ChIP-seq)
染色质免疫共沉淀（Chromatin Immunoprecipitation,ChIP），是研究体内蛋白质与DNA相互作用的经典方法。将ChIP与高通量测序技术相结合的ChIP-Seq技术，可在全基因组范围对特定蛋白的DNA结合位点进行高效而准确的筛选与鉴定，为研究的深入开展打下基础。
DNA与蛋白质的相互作用与基因的转录、染色质的空间构型和构象密切相关。运用组蛋白特定修饰的特异性抗体或DNA结合蛋白或转录因子特异性抗体富集与其结合的DNA片段，并进行纯化和文库构建，然后进行高通量测序，通过将获得的数据与参考基因组精确比对，研究人员可获得全基因组范围内某种修饰类型的特定组蛋白或转录因子与基因组DNA序列之间的关系，也可对多个样品进行差异比较。
应用方向：
ChIP 用来在空间上和时间上不同蛋白沿基因或基因组定位
- 转录因子和辅因子结合作用
- 复制因子和 DNA 修复蛋白
- 组蛋白修饰和变异组蛋白
技术优势：
- 物种范围广：细胞、动物组织、植物组织、细菌微生物多物种富集经验；
- 微量建库：只需5ng以上免疫沉淀后的DNA，即可展开测序分析；
- 方案灵活：根据不同的项目需求，选择不同的组蛋白修饰特异性抗体。
技术路线：
易基因提供全面的DNA与蛋白互作测序方案，详询易基因：0755-28317900.
参考文献：
Tan L, Wang S, Huang S, Tie Y, Sai N, Mao Y, Zhao S, Hou Y, Dou H. FoxO1 promotes ovarian cancer by increasing transcription and METTL14-mediated m6 A modification of SMC4. Cancer Sci. 2024 Feb 25. doi: 10.1111/cas.16120. PubMed PMID: 38403332.
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原文阅读：
ChIP-seq等揭示FoxO1增加SMC4转录和METTL14介导m6A修饰以促进卵巢癌发展 | 肿瘤研究
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