本人的生物只有高中且4年没碰的水平,如果涉及生物的笔记没写对请见谅.

1. 总览

2. MGI 测序原理

  MGI属于华大智造的专利技术,同样是用于测序.在解决下面三个问题上使用了不同的方法.
(1) 如何区分不同碱基:这里可以看作一致,是相似的技术.
(2) 荧光微弱:滚环扩增,形成DNA纳米球.要注意建库的时候就不一样,MGI建立的是环状的文库.
(3) 合成太快:相似的终止技术.

2.1 DNBSEQ技术原理——文库制备

  我们可以看到直到加接头那步出现了不同,MGI测序使用的是泡状接头,但后续PCR是一致的.接下来不一样的是从热变性开始.变性双链会变成单链的DNA,再对单链进行环化.如果只靠左右两个接头是无法环化的,还会有一个接口,所以这里还接了一个Split Oligo片段,最后形成了环状DNA.

  下面讲述一下环状DNA是怎么扩增的.里面是环状DNA,我们要复制这个DNA,首先使用橙色的DNA片段作为引物,然后沿着环状开始复制,但是复制到尾巴,是不会拼接的,也就是说有缺口.新复制的DNA片段尾部会将橙色部分翘起来,然后继续复制.

  橙色部分翘起为了区分画作绿色,继续合成蓝色接头,再沿着原来的初始环状合成紫色的DNA片段,我们可以将这段扩增展开,最后是一条链.

-------------这段建议看原视频,真的很难形容--------
  接下来直接对这个DNA分子进行测序.但是从第一个蓝色接头开始合成并没有做到放大荧光.所以同时有多个合成.

  所有拷贝都连上测序引物(绿色).同时开始合成,荧光就会变强,同样末端终止法一个个测序.但是测序同样是只测适当的碱基数(老师说的是150个).

  我们也可以继续合成,但是到末端,后一个DNA分子会被前一个DNA分子顶起来.

2.2 与Illumina 测序比较

  滚环扩增的一个劣势是环化不一定成功,且效率比较低,所以开始扩增前使用的DNA浓度需要高一点,并且滚环扩增的步骤比桥式PCR步骤多,所以需要时间多一点.
  当然滚环扩增也存在优点.我们在原来的PCR扩增可以发现如果早期模板复制时,如果出现了差错(比如碱基突变),会出现连锁反应,导致后面的DNA分子合成也出现差错.此时也很难分辨到底突变前的DNA是正确的,还是突变后的DNA是正确的.
  但是滚环扩增没有这种劣势,因为滚环扩增是以原始的DNA分子为模板不断合成,是线性扩增.这种扩增还带来一个好处就是GC含量带来的偏向性也就低了,错误也不会被累积.

  这里还有一个标签跳跃的问题.这个是Illumina公司所采用的基于ExAmp(排他性扩增)技术的测序平台,会出现其他游离的接头连接到插入DNA片段的情况,导致后面扩增出现连锁错误(请注意原理,index也参照模板链合成了).BGI也是因为线性扩增才解决这个问题.

2.3 DNBSEQ技术原理——放置在flowcell

  扩增的DNA分子相互缠绕形成了一个毛线球状的分子,分子带负电,flowcell用于存放该分子的带正电,正负相吸可以吸引过去.但是不是所有分子都可以精准落到位置上.请注意flowcell不是多个lane,而是阵列式圆点.