易基因：Adv Sci：NSUN2介导m5C修饰代谢重编程促进肿瘤进展 揭示治疗新选择｜项目文章

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喜讯！易基因表观转录组学RNA-BS技术服务见刊《ADVANCED SCIENCE》

表观遗传修饰包括有丝分裂遗传和稳定的修饰，这些修饰在不改变基础DNA序列的情况下调控基因表达。通常癌症中的表观遗传失调表现为突变、表观遗传修饰酶异常表达以及相关辅因子水平变化。其中5-甲基胞嘧啶（m5C）是一种普遍存在的RNA修饰，参与RNA代谢调控和多种肿瘤发生过程。结直肠癌（CRC）是癌症相关死亡的第二大原因，全球范围内第三大最常见的恶性肿瘤。主要的治疗方法包括手术、化疗和放疗，但CRC患者预后仍然不佳，转移性CRC的5年生存率仅为13.1%。越来越多的研究证实m5C修饰与包括膀胱癌（BLCA）、食管癌（ESCA）、胃腺癌（STAD）和肝细胞癌（LIHC）在内的多种癌症的致癌和肿瘤发生之间的复杂关系。然而，m5C修饰是否可能有助于促进CRC进展仍未充分阐明。

2024年5月20日，武汉大学中南医院江从庆教授/ Jianhong Zhao/任相海/解萧宇共同通讯在著名OA期刊《Advanced Science》发表题为“Metabolic Recoding of NSUN2-Mediated m5C Modification Promotes the Progression of Colorectal Cancer via the NSUN2/YBX1/m5C-ENO1 Positive Feedback Loop”的研究论文。研究通过RNA-Bis-seq等分析鉴定出m5C甲基转移酶NSUN2在CRC中表达水平升高及其在CRC中的致癌作用，以及潜在的遗传和分子机制。NSUN2诱导的代谢重编程以m5C依赖性方式调控ENO1表达增强葡萄糖代谢，导致CRC细胞中乳酸产生增加。此外，乳酸不仅通过组蛋白H3K18乳酸化（H3K18la）激活NSUN2转录，还诱导NSUN2在Lys356残基（K356）发生乳酸化，这对于捕获靶RNA和ENO1 mRNA m5C修饰至关重要。研究还鉴定出一种有效的NSUN2小分子抑制剂，可降低酶的功能和下游标靶表达，为CRC免疫治疗提供了一种新颖且有希望的治疗选择。总之，本研究揭示了一个NSUN2/YBX1/m5C-ENO1信号轴的正反馈回路（Positive Feedback Loop），从而连接了代谢重编程和表观遗传重塑之间的联系。易基因科技为本研究提供m5C甲基化修饰的RNA-Bis-seq技术服务。

标题：Metabolic Recoding of NSUN2-Mediated m5C Modification Promotes the Progression of Colorectal Cancer via the NSUN2/YBX1/m5C-ENO1 Positive Feedback Loop（NSUN2介导的m5C修饰的代谢重新编码通过NSUN2/YBX1/m5C-ENO1正反馈回路促进结直肠癌进展）

时间：2024.5.20

期刊：《先进科学》（Advanced Science）（中科院1区Top期刊，影响因子15.1）

实验方法： IP 和 Western blotting、mRNA BS-seq、RNA-seq、PAR-CLIP、荧光素酶报告基因检测等

研究摘要：

5-甲基胞嘧啶（m5C） RNA修饰，最近作为关键的转录后基因表达调控因子而受到关注，与多种肿瘤形成过程密切相关。然而，m5C修饰在结直肠癌（CRC）发生和进展过程中的确切机制仍不清楚。本研究鉴定出CRC中m5C甲基转移酶NSUN2表达显著升高，并发挥致癌作用。从机制上讲，NSUN2和YBX1被鉴定为ENO1的识别蛋白“writers”和阅读蛋白“readers”，最终以m5C依赖性方式重编程葡萄糖代谢，并增加乳酸产生。而CRC细胞的乳酸积累通过组蛋白H3K18乳酸化（H3K18la）激活NSUN2转录，并诱导NSUN2在Lys356残基（K356）发生乳酸化。这些结果共同揭示了一个参与NSUN2/YBX1/m5C-ENO1信号轴的正反馈回路，从而连接了代谢重编程和表观遗传重塑之间的联系，可能为将NSUN2抑制剂与免疫疗法相结合治疗CRC的治疗潜力提供线索。

结果图形：

（1）CRC中m5C水平升高和NSUN2表达增加

图1：结直肠癌（CRC）中m5C水平和NSUN2上调，并与CRC进展和转移相关。

1. TCGA数据库中癌症和正常组织的m5C相对水平比较分析。
2. CRC患者中m5C的代表性免疫组化染色（左）和定量分析（右）。
3. TCGA数据库中癌症和正常组织的18个m5C调控基因相对表达比较分析。
4. 在独立的配对CRC患者队列中，对18个m5C调控基因的倍数变化和P值进行等级排序分析。
5. NSUN2蛋白在对照结肠组织（Ctrl）和经AOM/DSS诱导的CRC小鼠或APCMin/+/DSS诱导的CRC小鼠（APCMin/+/DSS）肿瘤组织中的表达。
6. CRC队列中临床病理因素与NSUN2蛋白表达之间的关联饼图。

（2）NSUN2的缺失抑制了CRC肿瘤发生和转移

图2：NSUN2缺失在体外和体内抑制CRC的肿瘤发生和转移。

1. SW480和HT29细胞中transwell实验的代表性图像（左）以及随附的条形图显示了HT29细胞的相对侵袭数（右）。
2. NSUN2敲除或对照的HT29和SW480细胞的代表性集落形成结果（左），以及随附的条形图显示了HT29细胞的相对集落数（右）。
3. NSUN2敲除或对照的CRC细胞的肿瘤球体形成实验的代表性图像。
4. NSUN2敲除组和对照组小鼠皮下肿瘤的代表性图片。
5. 通过对照或NSUN2敲除CRC细胞形成的皮下肿瘤生长曲线。
6. 对照组或NSUN2敲除组形成的皮下肿瘤重量。
7. 小鼠尾静脉注射对照或NSUN2敲除CRC细胞后肺转移的代表性生物发光和HE染色图像。
8. 对照组或NSUN2基因敲除组的肺转移数量和肺重量统计分析。
9. CRC脾内肝转移小鼠模型示意图。
10. 脾脏远端注射对照或NSUN2敲除CRC细胞后小鼠肝转移的代表性生物发光和HE染色图像。
11. AOM/DSS诱导的原位CRC小鼠模型示意图。
12. 在AOM/DSS诱导的原位CRC模型中，Nsun2+/+和Nsun2-/-小鼠的体重曲线。
13. Nsun2+/+和Nsun2-/-小鼠在AOM/DSS诱导的原位CRC模型中的存活曲线。
14. AOM/DSS诱导的原位CRC模型中Nsun2+/+和Nsun2-/-小鼠的结肠肿瘤代表性图像。
15. Nsun2+/+和Nsun2-/-组小鼠结肠直肠肿瘤总数比较分析。
16. Nsun2+/+和Nsun2-/-组小鼠结肠直肠肿瘤数量指示大小比较分析。

（3）NSUN2介导的m5C 修饰通过靶向 CRC 中的 ENO1 导致葡萄糖代谢重编程

NSUN2是一种重要的m5C甲基转移酶，作者分析了NSUN2如何以m5C依赖性方式参与结直肠癌（CRC）的发生和进展。对NSUN2基因敲除（KO）和对照CRC细胞进行了RNA测序（RNA-Seq）和RNA亚硫酸盐测序（RNA-BiS-Seq）（图3A）。总共通过RNA-Seq鉴定了829个差异表达基因（DEGs），包括482个下调基因和347个上调基因（图3B）。基因本体（GO）分析显示，这些DEGs富集在与葡萄糖代谢相关通路中，包括经典的糖酵解、葡萄糖至丙酮酸分解过程、通过果糖-6-磷酸的糖酵解过程、NADH再生和葡萄糖分解过程（图3C）。KEGG分析显示，NSUN2缺失影响了CRC细胞中的碳代谢（中心碳代谢）和糖酵解。与这些发现一致，NSUN2基因敲除降低了SW480和HT29细胞中的葡萄糖消耗和乳酸产生，并同时抑制了细胞外酸化率（ECAR）（图3D、E）。接着，研究了NSUN2缺失如何减弱CRC细胞中的糖酵解代谢。RNA-BiS-Seq分析显示，在NSUN2基因敲除组中，不同染色体和基因区域的甲基化水平显著降低（图3F）。RNA-BiS-Seq和RNA-Seq的综合分析表明，与对照组相比，NSUN2基因敲除CRC细胞中ENO1的m5C甲基化和mRNA水平显著降低（图3G）。研究人员分析了NSUN2介导的m5C修饰对ENO1的影响。RT-qPCR分析和Western Blot分析结果表明，NSUN2敲低和基因敲除显著降低了CRC细胞中ENO1 mRNA（图3H）和蛋白水平（图3I），而NSUN2过表达则结果相反（图3H、I）。使用ENO1特异性引物的亚硫酸盐PCR测序（BSP）结果表明，在NSUN2缺失的CRC细胞中，ENO1位点甲基化沉默（图3J）。在TCGA数据分析中，NSUN2的RNA表达与CRC中ENO1水平呈显著正相关（图3K）。为了进一步验证NSUN2在调控ENO1的致癌功能是否依赖于m5C甲基转移酶活性，通过在释放位点（半胱氨酸271）或催化位点（半胱氨酸321）引入点突变，构建了两个非功能性NSUN2突变体，目的是破坏其m5C酶活性。结果表明，确实只有野生型（WT）NSUN2过表达才能在NSUN2KO CRC细胞中恢复ENO1 mRNA（图3L）和蛋白水平（图3M）。NSUN2介导的m5C修饰可能通过增加mRNA稳定性来维持ENO1表达。如图3N,O所示，在NSUN2KO细胞中，ENO1 RNA的半衰期在使用放线菌素D处理后显著降低，而NSUN2WT过表达逆转了这种降低，但NSUN2C271A或NSUN2C321A突变体则没有。同样的，在AOM/DSS诱导的Nsun2+/+小鼠中观察到的组织学异常中ENO1的水平也高于Nsun2-/-小鼠（图3P）。在体外拯救实验中，ENO1过表达逆转了NSUN2基因敲除CRC细胞中的增殖和侵袭能力下降，以及葡萄糖代谢的下降（图3Q）。但在体内实验中，ENO1基因敲除背景下NSUN2过表达未能有效恢复降低的皮下植入CRC肿瘤，表明ENO1可能是NSUN2的一个关键下游靶标（图3R–T）。所有这些发现证明了ENO1在NSUN2介导的m5C修饰中的关键作用，有助于CRC中葡萄糖代谢的重编程。

图3：NSUN2介导的m5C修饰通过靶向CRC中的ENO1导致葡萄糖代谢重编程。

1. CRC细胞中RNA-Seq和RNA-BiS-Seq过程插图。
2. 对照组和NSUN2基因敲除组的基因表达差异热图。
3. 对照组和NSUN2基因敲除CRC细胞组差异表达基因的GO分析。
4. 对照组和NSUN2基因敲除SW480细胞之间相对葡萄糖摄取和乳酸产生比较。
5. 对照组和NSUN2基因敲除SW480细胞的ECAR分析。
6. 对照组和NSUN2基因敲除组的不同基因组区域平均甲基化水平比较。
7. RNA-Seq和RNA-BiS-Seq综合分析鉴定基因表达和m5C甲基化水平上显著变化的mRNAs分布。

H-I. 指定载体处理后CRC细胞中ENO1的mRNA和蛋白表达水平分析。

J. Sanger分析对照和NSUN2基因敲除CRC细胞ENO1 RNA中的m5C位点。

K. TCGA-CRC数据库中ENO1和NSUN2相对mRNA表达水平的相关性分析。

L-M. 指定载体处理后CRC细胞中ENO1的相对mRNA和蛋白表达水平。

N-O. SW480和HT29细胞经指定载体处理后ENO1 mRNA半衰期分析。

P. 在AOM/DSS诱导的CRC模型中，Nsun2+/+和Nsun2-/-小鼠肿瘤组织中NSUN2和ENO1蛋白表达水平。

Q. 在NSUN2基因敲除CRC细胞中ENO1过表达后乳酸产生的拯救实验。

R. 荷瘤小鼠体内拯救模型（每组n=5只小鼠）的解剖皮下肿瘤图像。

S. 每4天检测一次的荷瘤小鼠皮下肿瘤体积的时间进程评估。

T. 指定组别皮下肿瘤最终重量散点图。

（4）YBX1作为m5C reader识别和稳定ENO1

图4：YBX1作为m5C reader，识别和稳定ENO1 mRNA。

1. CRC细胞中RNA下拉和质谱分析过程插图。
2. 使用SDS/PAGE随后用银染法对Input和RNA下拉蛋白质进行分析。
3. 质谱分析后，从RNA下拉获得的潜在ENO1[m5C]结合蛋白进行Western blotting分析。
4. CRC细胞中YBX1与ENO1结合能力的PAR-CLIP-qPCR分析。
5. YBX1 CSD和ENO1 m5C RNA寡聚物复合物表面静电电势。YBX1 CSD结构域对m5C的识别。
6. 通过MST定量分析未修饰或m5C修饰的ENO1 RNA低聚物与YBX1-CSD的结合亲和力。
7. TCGA-CRC数据库中ENO1和YBX1相对mRNA表达水平的相关性分析。
8. NSUN2敲低或基因敲除的CRC细胞中YBX1蛋白水平的Western blotting分析。
9. 在NSUN2敲低的SW480细胞中YBX1与ENO1 RNA结合能力的PAR-CLIP-qPCR分析。
10. 在NSUN2敲低的HT29细胞中YBX1与ENO1 RNA结合能力的PAR-CLIP-qPCR分析。
11. YBX1在SW480细胞中与ENO1 RNA结合能力的PAR-CLIP-qPCR分析。
12. YBX1敲低的CRC细胞中ENO1 mRNA相对表达水平的RT-qPCR分析。
13. YBX1敲低的CRC细胞中ENO1蛋白相对表达水平的Western blotting分析。
14. YBX1敲低SW480细胞ENO1 mRNA的RNA半衰期分析。
15. NSUN2基因敲除的SW480和HT29细胞中，通过HA-YBX1下拉的RNA的PAR-CLIP分析。
16. 在NSUN2基因敲除并转染Flag-EV、Flag-NSUN2WT或Flag-NSUN2DM的SW480细胞中，由HA-YBX1敲低的RNA的Rescue PAR-CLIP分析。
17. 在对照或稳定的YBX1过表达SW480细胞中野生型ENO1-m5C位点（ENO1WT）或突变m5C位点（ENO1MUT）的荧光素酶报告基因分析。
18. 在对照或稳定的YBX1过表达HT29细胞中ENO1WT或ENO1MUT的荧光素酶报告基因分析。

（5）肿瘤源性乳酸通过组蛋白乳酰化诱导NSUN2表达上调

图5：肿瘤源性乳酸通过组蛋白H3K18乳酸化激活NSUN2转录，并直接诱导K356位点的NSUN2乳酸化。

1. 说明ENO1在葡萄糖代谢中功能作用的代谢流程图。
2. 对经25 mM L-乳酸处理指定时间的CRC细胞全细胞裂解液中指定蛋白的Western blotting分析。
3. 经si-NC或si-LDHA或si-LDHB或2-DG处理的CRC细胞中NSUN2和ENO1蛋白水平的Western blotting分析。
4. 在TCGA-CRC数据库中，NSUN2与MCT1相对mRNA表达水平的相关性分析。
5. 对添加25 mM L-乳酸的CRC细胞全细胞裂解液中指定蛋白水平的Western blotting分析。
6. 对经25 mM L-乳酸处理24小时或经组蛋白乙酰转移酶p300抑制剂(C646或A485)处理24小时的CRC细胞全细胞裂解液中指定蛋白的Western blotting分析。
7. 对经25 mM L-乳酸或500 nM rotenone处理24小时的CRC细胞中NSUN2相对于Input水平进行ChIP-qPCR分析。
8. ENO1敲低CRC细胞全细胞裂解液中指定蛋白的Western blotting分析。
9. 说明NSUN2通过ENO1调控促进NSUN2转录形成正反馈回路图表。
10. 用于预测NSUN2和L-乳酸分子之间结合亲和力的分子对接。

L. 对经25 mM L-乳酸处理或未处理24小时的CRC细胞核和细胞质部分中NSUN2相对表达的Western blotting分析。

M. 对经25 mM L-乳酸处理或未处理24小时的SW480细胞中NSUN2蛋白的免疫荧光分析。

N. 对经指定载体和L-乳酸处理并在UV交联后的CRC细胞中指定目标的免疫沉淀和Western blotting分析。

O. 对不同处理的CRC细胞中相对RNA表达水平的RT-qPCR分析。

（6）NSUN2小分子高效抑制剂与免疫疗法联合应用鉴定

图6：鉴定出一种有效的NSUN2小分子抑制剂及其与免疫疗法的联合应用。

1. 从ChemDIV数据库中鉴定NSUN2抑制剂的金字塔流程图。
2. 基于NSUN2晶体结构的活性口袋和2091804种化合物开发了对接模型。
3. 前5种抑制剂在NSUN2蛋白催化中心的对接姿态（左）。这5种小分子抑制剂的2D结构（右）。
4. 使用小分子抑制剂Nsun2-i4处理后的CRC细胞的CCK8分析。
5. Nsun2-i4抑制剂与NSUN2蛋白之间互作的MST分析。
6. 在SW480和HT29细胞系中暴露于15 μM Nsun2-i4 12小时后的指定蛋白的Western blotting分析。
7. 小分子抑制剂（Nsun2-i4）在C57BL/6N小鼠中的给药示意图（左）。经Nsun2-i4处理的小鼠模型的肝脏、脾脏、肾脏和结肠的HE染色（右）。
8. AOM/DSS诱导的正位小鼠模型中NSUN2小分子抑制剂（Nsun2-i4）的示意图。
9. 在AOM/DSS诱导的原位CRC模型中，对照组和Nsun2-i4处理组小鼠的结肠肿瘤典型图像（左）。对照组和Nsun2-i4组小鼠结肠肿瘤总数比较（中）。对照组和Nsun2-i4组小鼠指定大小的结肠肿瘤数量比较（右）。
10. 小分子抑制剂（Nsun2-i4）和PD-1在同源C57BL/6N小鼠中的联合疗法效果示意图。
11. 在同源C57BL/6N模型结束时，来自荷瘤小鼠的皮下肿瘤的解剖图像（每组n=5只小鼠）。
12. 在C57BL/6N小鼠中每4天测量一次的皮下肿瘤体积的时间进程评估。
13. 指定组别皮下肿瘤最终重量散点图。

（7）NSUN2和ENO1与CRC患者葡萄糖代谢相关

图7：NSUN2和ENO1与结直肠癌（CRC）患者的葡萄糖代谢相关。

1. 临床CRC患者组织与PET-CT结果整合及葡萄糖代谢分析示意图。
2. CRC患者基于PET-CT SUVmax值的葡萄糖代谢的排名表。
3. CRC患者高葡萄糖代谢组和低葡萄糖代谢组的代表性PET-CT图像。
4. 在高代谢和低代谢组中NSUN2（左）和ENO1（右）的相对RNA表达水平。
5. NSUN2相对RNA表达水平与肿瘤SUVmax（左）的相关性分析。ENO1相对RNA表达水平与肿瘤SUVmax（中）的相关性分析。CRC患者中NSUN2与ENO1相对RNA表达水平（右）的相关性分析。
6. 本研究提出的关键发现的示意图总结。

研究总结：

本研究揭示了一个非常有趣的正反馈回路，在该回路中，NSUN2促进并稳定ENO1 mRNA，然后增强糖酵解并增加由于ENO1上调而产生的乳酸，回过来又刺激NSUN2转录。因此，靶向NSUN2可能破坏这一正反馈回路。最近研究进展表明，乳酸作为调节性T细胞（Treg细胞）的代谢检查点，并通过上调PD-1表达调控肿瘤微环境中的免疫反应。此外，研究鉴定了NSUN2激活维持了整体m5C RNA甲基化，并稳定TREX2以限制细胞质dsDNA积累和cGAS/STING激活，最终促进肿瘤发生和对anti-PD-L1免疫疗法的抗性。为了提高这项研究的潜在临床适用性，本研究使用基于分子对接的虚拟筛选从ChemDIV数据库中筛选出NSUN2的小分子抑制剂，并确定Nsun2i-4为一种在体内无明显毒性的有效抑制剂。采用CRC同源小鼠模型进一步评估NSUN2抑制剂与PD-1阻断联合的疗效，令人鼓舞的结果支持了NSUN2在CRC癌症免疫疗法中的潜力。最终，通过使用PET-CT和TCGA数据库的大规模基因组测序数据对独立的临床CRC队列进行分析，验证了这一调控轴的可靠性。独立临床队列结果和TCGA数据分析进一步证实了高葡萄糖代谢组中NSUN2和ENO1表达水平升高。与TCGA-CRC队列中糖酵解低/NUN2低/ENO1低特征的患者相比，糖酵解高/NSUN2高/ENO1高特征的患者分别显示出显著的生存益处。

总之，本研究专注NSUN2/YBX1/m5C-ENO1信号轴的大量工作可能为结直肠癌的发病机制和表观遗传-免疫靶标的鉴定提供有价值的见解。

关于易基因RNA m5C甲基化测序(RNA-BS)技术

m5C是RNA百余种修饰中研究较多的一种。m5C存在于tRNA上时，可以对翻译进行调节；存在于rRNA上时，可以对核糖体的生物合成进行质控；存在于mRNA上时，则可以影响mRNA的结构、稳定性及翻译过程。

易基因提供适用于不同科研需求的m5C甲基化测序技术：

• 常规mRNA m5C甲基化测序（RNA-BS）：
  mRNA分离后首先通过亚硫酸盐处理，非甲基化的C转变为U，m5C修饰的碱基保持不变，结合高通量测序，可以对RNA上的每一个C碱基修饰进行定位与定量。
• 常规mRNA +lncRNA m5C甲基化测序（全转录组RNA-BS）：

易基因科技建立的升级版m5C RNA甲基化测序服务，去除人rRNA后，剩余RNA经重亚硫酸盐处理后，结合高通量NGS策略，可在全转录组范围内单碱基分辨率地检测基因m5C甲基化修饰分布。

技术优势：

• 高深度：超高深度重亚硫酸盐处理，检测准确性极高；
• 高通量：结合高通量NGS，全转录组范围内检测；
• 单碱基：单碱基分辨率，快速检测和分析RNA中的m5C。
• 高准确：精确的检测mRNA等每一个C碱基的的修饰水平。

研究方向：

• 与m6A甲基化类似，m5C甲基化已被证明与肿瘤、神经系统紊乱、代谢性疾病、病毒感染以及个体发育等密切相关。
• 此外，RNA甲基化（m5C）与人类疾病密切相关，其功能涉及调控干细胞应激、细胞毒性应激、mRNA出核和植物细胞发育及基因表达等方面。

实验策略：

易基因提供全面的表观基因组学（DNA甲基化、DNA羟甲基化）和表观转录组学（m6A、m5C、m1A、m7G）、染色质结构与功能组学技术方案（ChIP-seq、ATAC-seq），详询易基因：0755-28317900.

参考文献：

Chen B, Deng Y, Hong Y, Fan L, Zhai X, Hu H, Yin S, Chen Q, Xie X, Ren X, Zhao J, Jiang C. Metabolic Recoding of NSUN2-Mediated m5C Modification Promotes the Progression of Colorectal Cancer via the NSUN2/YBX1/m5C-ENO1 Positive Feedback Loop. Adv Sci (Weinh). 2024 May 20:e2309840. doi: 10.1002/advs.202309840. PubMed PMID: 38769664.

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