KASP标记与农作物育种

• KASP的特点
• KASP的原理与步骤
  • 原理
  • 步骤
    • （1）引物和探针设计
    • （2）普通PCR扩增
    • （3）荧光检测和分析
• KASP与农业育种

KASP的特点

在过去30 年中，分子标记从低通量限制性片段长度多态性（RFLP）开始，到最近达到的基于NGS 技术的SNP 标记，已经经历了三代。竞争性等位基因特异性PCR（kompetitive allele-specific PCR，KASP）是一种基于荧光的同质基因分型技术，最初由英国KBioscience 公司所开发，在2011 年被英国的LGC 公司收购。LGC公司开发出了一套灵活、快速且高通量的SNPline仪器平台和实验方案，基于该公司的平台，每天可检测的SNP 数量从20-500 000 个，样本数可从单个到数万个以上，有很强的灵活性。

KASP 技术具有灵活、便宜、准确等特点。
一方面，它以常规PCR 和荧光检测为基础，能够在普通实验室操作的基础上满足低、中、高通量基因分型的要求。
另一方面，KASP 作为TaqMan的替代品，在原理上与TaqMan 类似（也是基于终端荧光读取判断），不同之处在于：其采用的是通用探针，可以与各种不同的基因特异引物配合使用，而不需要针对每个特定的位点进行探针合成，这极大降低了实验的试剂成本（约80%）。
KASP 不依赖于凝胶电泳，不需要专门的设备，可以使用常规的qPCR 仪器进行SNP 基因分型，具有良好的兼容性。
通过设计两个引物对等位基因特异性单核苷酸多态性位点进行不同方向的扩增，可以将单核苷酸多态性转化为长度多态性。
将KASP与TaqMan相比具有更高的分析设计成功率和转化为成功的工作检测，与基于芯片的Illumina GoldenGate平台相比具有较高的准确性。

选择KASP 分析的几种方式：向LGC 公司或其他商业测试公司提供核酸样本和引物进行检测；通过订购KASP 试剂，自行利用qRT-PCR 仪进行结果分析；购买全套检测设备，建立自己的高通量SNP 分析平台。

KASP的原理与步骤

原理

基于荧光检测的基因分型技术，在DNA 样品中对特定位点上的SNPs 和InDels进行精准的双等位基因检测。具体的检测体系包括：DNA 模板、2 个通用荧光探针、2 个通用淬灭探针、2 个与目标位点特异结合的引物以及共同的反向引物。
该技术是基于引物末端碱基的特异匹配来对SNP 以及InDel 位点进行检测，即基于PCR 反应结束后的荧光读取工作。针对每个孔采用双色荧光检测，一个样本对应一个检测位点，而每个位点都存在3 种可能的基因型（纯合1，纯合2 或杂合），极大地提高了检测效率。

步骤

（1）引物和探针设计

首先设计针对特定SNP 的2 个正向PCR 引物，每个引物通过调整3' 末端来对应一个SNP 的等位基因。例如下图，等位基因1 引物3' 末端对应A，等位基因2 引物3' 末端对应C。
其次，在每个正向引物的5' 末端添加标签序列，如图中的标签序列1 和2。
此外，设计与标签序列对应的荧光探针，如探针1 和探针2。在探针1 的5' 端添加有FAM 荧光基团，探针2 的5' 端添加有HEX荧光基团。
同时，对应2 个探针，各设计一个3'端带淬灭基团的淬灭探针。在实际操作中只需要针对特定SNP 设计添加5' 末端标签序列的普通引物即可，而探针通常由试剂盒提供。

（2）普通PCR扩增

在第一轮PCR 扩增中，等位基因特异引物（3'末端能配对的）就可识别特定等位基因模板，完成等位基因识别（图）。
从第2 轮PCR 扩增开始，产物中出现携带通用标签序列的模板，这步完成把通用标签序列引入与SNP 对应的PCR 产物中。
随后在PCR 扩增过程中，携带荧光的探针通过与通用序列互补的DNA 链结合而添加到PCR 产物中，经多轮PCR 扩增，更多的荧光探针退火到新合成的、没有淬灭基团的互补链上，而逐渐增强PCR 产物荧光强度。

（3）荧光检测和分析

利用专用的荧光信号检测仪或普通的荧光定量PCR 仪（配有FAM 和HEX 检测通道）进行信号读取并用软件采集信号和判别等位基因类型。

KASP与农业育种

现在，KASP技术在种质资源鉴定、亲缘关系研究、分子标记辅助育种、遗传图谱构建与基因定位、种子纯度鉴定等应用广泛（表）。

来源：刘巧泉等，（2022）

但传统的SSR等标记仍然是大多数研究者常用的标记技术，原因有：SNP有大量冗余信息；SNP难以与功能基因位点关联。

KASP的问题：因受到SNP附近序列限制而造成所设计的引物无法有效进行PCR扩增；模板DNA 质量要求高。

提升KASP技术的利用效率：

• 在基础研究领域注重基因功能位点的收集和汇总，建立相关功能基因多态性位点的KASP 数据库。
• 为提高对未知样本的检测效率，在开发功能性KASP 标记的同时，应当建立相配套的阳性对照标准品。
• 实验室小规模检测条件下应当保证模板DNA 的质量并调整到相似的浓度。

参考：杨青青 唐家琪 张昌泉 高继平 刘巧泉，KASP 标记技术在主要农作物中的应用及展望，生物技术通报，2022, 38(4):58-71