CHIP-qPCR引物设计

一、CHIP-qPCR作用

        CHIP-qPCR（染色质免疫共沉淀结合定量聚合酶链反应）是一种用于研究蛋白质与DNA相互作用的技术。它结合了染色质免疫共沉淀（ChIP）和定量聚合酶链反应（qPCR）两种方法，具有以下几个主要作用：

1. 分析蛋白质与DNA的相互作用：CHIP-qPCR可以用来检测特定蛋白质（如转录因子或组蛋白修饰）在基因组中的特定位点的结合情况。

2. 验证ChIP-seq结果：在完成ChIP-seq分析后，研究人员通常会找到感兴趣的转录因子或组蛋白修饰的靶基因，CHIP-qPCR可以用来进一步证实这些结合状态。

3. 定量分析：与全基因组测序方法相比，CHIP-qPCR更便宜、更省时，可以对多种样品中的特定基因组区域进行快速和定量比较。

二、基于测序数据的CHIP-qPCR

        如果前期已经进行ATAC-seq、CHIP-seq、cut&tag-seq 或/和 cut&run-seq等检测分析，并拥有一些感兴趣的潜在靶基因，且这些基因上鉴定到peak的存在，可以使用IGV软件分别对这些peak在染色体上进行可视化。具体流程如下：

1. 寻找目的基因上的peak       无论是自己进行测序分析，还是找生物平台进行测序分析，最终都会有如上图所示的peak鉴定与注释结果表格，根据需要筛选出基因和其上peak即可。
          简单介绍一下表格中每列内容：
   A列：是peak所在染色体编号；
   B和C列：是该peak在具体染色体上的位置；
   D列：是peak的长度；E和F列是进行peak鉴定的一个关键参数：p和q值取-log10，一般要求p<0.05，严格的话使用q<0.05；
   G列：是进行peak鉴定的另一个关键参数：可以简单理解为IP：Input的富集倍数（实际没那么简单）；
   H列：是该peak位于基因上功能元件的位置；
   I列：是peak所在基因的Ensembl_ID；
   其他列：基因的名称和位置信息等。
          注：请根据您实际的表格信息查看，A-I列内容是肯定会有的，可能命名不同而已！
2. peak可视化文件准备

   

   简单粗暴，要么是bw格式，要么是tdf格式。一般一个样本会有IP和Input两个文件，而ATAC-seq等只有一个bw/tdf格式文件，因为这个技术用的Tn5酶切。
3. 参考基因组获取
           进行上述测序，那可定是有对应的参考基因组序列文件（.fna格式）和注释文件（.gff/.gtf/.gff3格式），准备好这两个文件，如果是找生物工作的分析，让公司提供他们进行参考基因组建库用的这两个文件。
          有小伙伴就要问了，我直接下不行吗？不建议。因为不知道生物公司构建的参考基因组文库有没有调整过内容。如果调整过：使用自己的参考基因组用IGV加载后，peak可视化用的.bw/.tdf等文件无法识别出来，或者识别不完整等。
4.  IGV软件下载
   IGV软件官网下载地址（免费软件）：IGV: Integrative Genomics Viewer
          建议使用2.10.0版本，别问为啥，截至目前新版本的IGV加载参考基因组和注释文件需要分开加载，虽然减少了内存资源占比，但时间翻倍（新版本适用于参考基因组文件小的物种，或者电脑运行内存小于16GB的小伙伴）。下载安装包后，直接安装就行，没啥需要特别配置的。
5. peak可视化第一次打开IGV软件是如上图所示的一个初始页面。
   
   折腾那么久，此处开始让你看见心心念念的peak是个啥样的：
   
   简单介绍一下界面都是些啥
   
   加载测序得到的.bw/.tdf文件，并进行调整处理：

   

   
   打开后是下图这样滴：
   

        然后根据进行调整，此处用的CHIP-seq数据，采用IP-Input可视化，注：这里如果是ATAC-seq数据没有这一步；如果小伙伴想看RNA甲基化（IP方法检测的）数据，请采用IP/Input。当然了，也可以将两者调整显示值范围调整一致，然后不对IP和Input进行计算处理，或者将两个重叠映射在一起进行展示。 

• 无论哪一种方法，请养成习惯，第一步先把显示峰值范围调成一致，并把注释文件展开（有的基因存在剪切变体，或者基因间有重合的地方，需要展开）：

• 方式——IP-Input： 

因为每次只能处理一个样本，所以多样本采取相同的步骤进行处理就好了，最后得到下面这样的： 

有了IP-Input的文件，就可以将IP和Input文件移除了，然后调整每个样本界面（Track）的高度： 

移除后结果是这样的 ：

然后调整 每个样本界面（Track）的高度：

弹出框中输入合适数值（自己多调整哈，毕竟样本越多，这里数值就越小才行），这里两个样本的话，可以填一个200，然后点击确定： 

结果这样滴：

展示（差异/peak表中得到的）目标基因，我随机输一个基因了哈： 

 结果这样滴：

标记peak所在位置：打开你的peak鉴定表或者差异peak表，这里我随机弄一个位置哈（如Chr:90067835-90068315）,然后跟我一起点点点 :

结果如下，peak就是绿色框框的区域（为了方便看，手动截图标记的），对应红色块 ：

 如果想要调整不同样本展示为不同颜色，跟我继续点点点：

我就选择一个丑丑的红色了，结果如下： 

多提一句，可以通过以下不揍调整展示基因界面宽度：

言归正传，找到peak区域，下一步将peak这一段区域复制出来，然后放到word文档里面中：

 如果peak很短（小于400 bp），我们可以在上面的基础上，进行以下点点点：

得到这个序列后，使用引物设计软件进行CHIP-qPCR引物设计，设计要求：

       1.扩展区域：在peak区域内或包含peak区域；

       2.产物长度：100-200 bp，最佳150 bp；

       3.GC%/引物长度等要求同qPCR。

Ok了，到这里引物就设计完了。

再多提一句：这里用的IP-Input作图，如果其他方法的话，操作也是一样的，一通则百通哈。

三、基于前人研究/拥有目标基因

        如果有目标基因或者前人在同一物种中研究过，而你不想做测序（因为贵，而且结果还不一定理想，毕竟CHIP实验不可控因素太多），当然，有经费还是做一下的好，毕竟现在是“大数据”时代。

        第一种情况-拥有目标基因：拥有目标基因，没人研究/不在本物种/不在近缘物种中研究过， 可以去UCSC或者Jaspar等网站搜索看看，研究的组蛋白/转录结合因子结合基序和位置什么什么样，然后参考这个基序和结果，在你的基因多个区域设计CHIP-qPCR引物，然后筛选有显著富集的区域即可。

四、CHIP实验过程

        此处不赘述，不同样本类型处理不一样。只需要记住IP和Input的实验用量比例即可，后续计算需要用到。此处以IP:Input=10:1为例，即稀释因子矫正参数DF=log2(10:1)。

五、结果计算

     看你做不做IgG，因此有两种富集度计算方法：

1. % (ChIP/ Total input)= 2^[(Ct(input) - DF) - Ct(ChIP)]x 100%；
2. % (IgG-IP/ Total input)= 2^[(Ct(input) - DF - Ct(IgG-IP)]x 100%

     然后根据计算结果，进行显著性分析（p<0.05，具有统计学意义就行，至于富集倍数相差多少，这个跟结合程度有关），绘制柱状图即可。

     又多说一句：MeRIP-qPCR的计算也是这样的哦！！！！

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