IP实验是研究蛋白质相互作用、揭示蛋白质作用机理中最常用最重要研究方法。作为一个专注于蛋白质研究的质谱公司,我们给全国大量课题组提供了IP产物的质谱检测,但是50%以上的课题组在首次IP实验中均存在较为明显的问题,严重影响了有效数据的获得以及数据的准确性。
所以我们长期呼吁在寻找互作蛋白的正式实验前,针对IP实验体系做方法学评估和优化。为了保障客户拿到高质量的数据,我们推出了免费IP实验效果评估的权益,扫描下方二维码,添加工作人员微信,按照推荐送样要求完成样本准备即可送样检测!
活动规则:
1、按照谱度众合实验指南要求设计实验;
2、按照谱度众合IP样本送样要求准备样本;
3、送一个样本做基于质谱的“IP效果评估”;
4、如果实验效果理想,补送后续正式筛选实验样本,则“IP效果评估”预实验样本免费;
5、如果实验效果不理想,优化实验条件补送预实验样本,最终正式实验样本送测后,免收一个预实验样本费用。
实验设计
IP实验的不确定性大部分来源于抗体的不稳定,有研究统计市面上在售的超过一半的抗体实际使用效果不符合预期,关于抗体的选择我们推荐四步法,详见<理想的IP-MS结果始于实验材料的选择>(点击左侧查看详情)。
其次IP实验结果的实用性、准确性不佳来源于我们的实验设计、样本准备形式、以及数据使用方式的经验不足。对于未来需要做IP实验的同学,推荐参考我们的<蛋白互作组学系列>(点击左侧查看详情)合集,其中介绍了从材料选择、实验设计、实验protocol、数据分析、常见问题等十几篇干货实验指南,相信会有帮助。
IP实验体系我们通常需要评估2个点:
1、抗体特异性
2、IP实验效率
抗体特异性
评估抗体的特异性是为了确保IP拉下来的蛋白确实是诱饵蛋白所富集的互作蛋白。如果抗体特异性不好,筛选的互作蛋白中混杂了假阳性的结果,当然我们没有办法完全避免这种假阳性,要求抗体只结合诱饵蛋白,这也是我们“50%以上验证成功率的实验方法”的口号没有办法达到100%的原因。
我们可以用WB来验证特异性,要求input和IP泳道条带特异,但是WB的评估仍然存在一些弊端。如质量大致相同的假阳性蛋白、轻重链的干扰等问题。使用质谱评估则没有这些担忧,我们要求诱饵蛋白排名靠前,通常情况下应排名第一,当然前提是像谱度众合数据一样基于蛋白相对丰度排名算法iBAQ排序。诱饵蛋白排名跌出前五我们则应该担忧抗体的特异性问题给后续验证带来的麻烦。
若WB结果类似A1,表明所用抗体可以用于IP实验,且抗体特异性良好;若结果类似A2,则表明所用抗体可以用于IP实验,但抗体特异性较差,除目的蛋白外还会识别其他非目的蛋白,结果中假阳性率可能较高;若结果类似A3,则无法证明所用抗体能够特异性结合并免疫沉淀目的蛋白,一般不能用于IP实验。
IP实验效率
即IP实验可以拉下来多少蛋白。IP实验普及率高,试剂盒和实验方法相对成熟,通常情况我们会理所应当认为这里不会出问题,但是实际情况是不少比例的实验室首次实验染色图中IP泳道没有条带或者条带浅和少。
这可能源于2种可能:
1、早期互作组学研究常常使用IP-WB的工作模式:基于文献形成猜想,以WB进行验证。但是WB具有多级抗体级联放大效应,并且是靶向检测,对于样本量的需求要少于质谱的非靶向性筛选。对于IP-WB,细胞量要求通常是6孔板的一个孔,但是对于IP-MS我们通常推荐2个10cm皿的细胞作为起始量。这可能是目前造成很多研究者质谱数据不理想的原因,通常研究者IP实验后会做一个WB评估,而忽略了染色胶图,WB显出目的蛋白条带后会认为实验符合预期,接着送测质谱。运气不好的同学返回的结果会出现数据量少、诱饵蛋白未检出或排名不好等情况,警觉的同学会发现数据的问题。如果经验较少的同学会使用这批数据开展后续验证工作。WB无法发现IP没有拉下来蛋白或拉下的蛋白量过少,获得的结果仅仅是质谱以强大的性能捕获的一些边角料信息,以这些信息进行后续实验很显然误导了研究者,这需要通过提升细胞量或优化IP实验体系来改善。
2、另一种可能也是基于以往的研究策略习惯,早期有一种较流行的研究策略是尽可能把beads上结合的非特异性蛋白给洗掉,然后认为洗脱下来的蛋白均属于相互作用蛋白。研究者会用多种清洗试剂分多次的清洗beads,目标是让最终检测的蛋白数量尽可能少。如果研究者误用了这类实验protocol,也会导致银染图条带较少,质谱数据不理想。实际上这种研究策略存在诸多问题,首先非特异性结合蛋白无法被有效清洗掉,不管如何洗使用高性能质谱仍然会检出数百至数千个蛋白,清洗过度也会导致原本结合蛋白丢失,我们往往很难掌握这个度。其次目前针对非特异性蛋白的排除有更好更准确的做法,我们推荐设置对照,保持细胞和抗体单一变量,同时保持其他实验条件不变,一般认为非特异性结合在组间是大致相当的。这时我们推荐弱清洗(保留更多弱相互作用)以定量方式筛选相互作用蛋白,通常我们的结果会显示出诱饵蛋白具有数百倍之高的组间差异且排名第一,以10倍高倍数在数千个非特异性结合蛋白中我们会筛选到几个到几十个不等的互作蛋白。该研究策略的关键是:保持对照组间可比、使用弱清洗、充足细胞保证样本量从而保证数据量、在大数据量中高标准筛选、增加重复稳定定量值,这一套下来我们相信互作蛋白的验证成功率轻松超过50%,唯一失败的原因就是由于抗体特异性不够完美,导致筛出来的并不全是咱们诱饵蛋白的互作蛋白。
我们可以找到非常多的IP实验方法,但是由于大家背后的实验策略不一样也可能让我们做了一个错误的借鉴,我们在<IP-MS蛋白互作解决方案>实验指南合集中提供了我们推荐的实验方法可以供大家参考。此外即使是仅限于IP-MS实验,随着技术和实验理念的发展,实验策略上也具有数次的变化发展,不同的实验策略也显现出非常大的效率差异,我们在如下视频中做了简要分享。
总之我们推荐老师在进行正式实验前应对IP实验的效率进行评估,通常的做法是进行跑胶考染,效果优秀的胶图应该是IP泳道和对照泳道均有数量众多、清晰的条带,并且泳道间总体一致的同时存在少量差异带条,目的带条差异尤为明显。如果使用质谱进行评估,则可以在一次检测中评估IP效率和抗体特异性,质谱返回数据应至少有数百个蛋白。如果评估中有对照样本,IP组和对照组间数据应大致相当,并且诱饵蛋白差异倍数排名第一。增加了对照样本对于抗体特异性的评估也有帮助,诱饵蛋白在组间差异倍数的排名相比于IP单组内的排名的评估更准确。
若SDS-PAGE染色结果类似B1,表明两组IP样品中蛋白量较高且具有差异,质谱检测可分析出明显的蛋白差异从而筛选出相互作用蛋白;若结果类似B2,表明两组样品中蛋白含量较低,提示IP实验的效率出现问题应做实验的优化。
质谱评估
基于样品中蛋白的检测数量、定量数据和诱饵蛋白检测情况等标准对项目数据进行多项评估。若结果评估为“理想结果”,表明IP实验效果和数据质量较高,基于此数据的蛋白互作分析结果可信度高;若评估结果中存在“Warning”,表明结果数据可能不太理想,基于此数据进行的蛋白互作分析结果中可能存在较多的假阳性和假阴性结果,建议根据提示优化调整实验方法;若评估结果中存在“Error”,则无法通过同类样品筛选可信的互作蛋白,需根据提示更改实验条件和样品后再进行检测和分析。
注意事项
此外需要强调的一点是,如果研究者自行使用WB和考染进行评估,通常喜欢将IP的整个泳道拿去质谱检测,这犯了一个巨大的错误。通常IP拉下来的蛋白量已经非常少了,我们将IP产物跑入胶中,然后到质谱实验室做胶回收,这中间走了一个巨大的弯路,导致了非常严重的数据损失和失真。这种情况在新接触客户中非常普遍,也是由于行业普遍的对于客户研究目的的忽视和不负责任导致的。我们在2019年全国首次提出使用beads形式送样,配合专门开发的针对beads样本的处理方法,让IP产物经历了最简洁的处理过程。目前市面多数公司也能接受beads形式送样,但仍然使用通用方法,这仅仅模仿了表面工作。针对客户具体研究目场景开发实验方法及分析方案是谱度众合区别于其他公司的核心,这源于我们十几年均专注在蛋白质谱细分领域。
通常我们建议单独准备样本做方法学评估,如果有的同学不想重复2次实验,我们可以在清洗步骤后将beads 分成2份,其中1/4拿去方法学评估,可以跑胶做2张图(WB和染色),也可以送质谱评估。剩下3/4吸掉多余溶液-20℃保存,评估效果好直接拿出来送测质谱做正式实验。
总结
磨刀不误砍柴工——我们希望所有的研究者能够重视前期的方法学,构建好一个严谨完善的实验体系,然后集中资源获得一批高质量的前期数据,这样可以大大减少后续验证工作的经费和时间投入。根据多年的服务经验观察,全国不同课题组之间获得成果的效率差异巨大!这其中也体现在越是实力雄厚的实验室,越重视在实验前期投入时间和经费,往往整个课题算下来,反而使用更少的经费和时间拿到了更好的结果。而对于相对弱小的实验室,在前期方法学和重复上不舍得投入,有时候甚至在一个质量较差的数据上投入了大量的经费和时间去验证而没有意识到问题,为避免这种情况发生,我们的IP-MS数据报告第一个板块就是针对数据质量做评估,让研究者对本批次数据有一个准确的认识,是否需要优化,风险点在哪里?还是可以放心大胆使用。总之实验不易,谱度众合竭尽所能以多年的经验辅助研究者完成自己的课题,愿全天下没有难做的实验!
标签:IP,免费打,质谱,实验,蛋白,抗体,评估 From: https://blog.csdn.net/Specally/article/details/144773924