【Image J】——批量进行细胞荧光染色图像计数

     上期“【Image J】荧光染色图像处理”介绍如何使用Image J软件处理不清晰或“难看”的荧光染色照片，以及将两张或多张荧光染色图片进行merge操作的方法。本期将介绍如何使用Image J软件对EDU或其他荧光染色图片的细胞进行批量计数方法。

今日份干货分享导航：

1  批量计数-宏记录创建；

2  细胞荧光染色图像计数；

3　荧光染色图片批量计数。

1 批量计数-宏记录创建

Step.1 打开ImageJ软件。打开以后出现一下界面既打开成功

Step.2 导入需要处理的荧光染色图片。在所在的文件夹中找到你所需要处理的荧光染色图片

以下为本次处理的照片

Step.3 宏记录创建。依次按以下顺序进行操作Plugins -> Macros -> Record。目的为记录后续单张荧光染色图片计数的全部步骤，从而达到批量处理的目的。

2　细胞荧光染色图像计数

Step.1 对 ImageJ 进行初始设置。依次按以下顺序进行操作 Process -> Binary -> Options -> 勾选Black background -> OK。目的是避免染色的细胞与背景混淆。这一步处理完后续的粒子是白色背景是黑色，根据需求进行这步操作，可不做直接进行Step.2，

Step.2 将荧光染色图片转为8-bit（既黑白灰色）。依次按以下顺序进行操作 Image -> Type -> 8-bit。目的是将RGB（红、绿、蓝）的图像转化为8-bit黑白图片，有助于后续步骤设置对比度临界值。

Step.3 调整阈值，去除背景，选中细胞。依次按以下顺序进行操作 Image -> Adjust -> Threshold -> 调整合适的阈值（此处设置的阈值为30和255，可根据具体情况进行调整，保证红色完全覆盖所有的粒子上） -> Apply。调整阈值目的是利用物体和背景的信号强度的差异，从而来分割出细胞。

PS：被红色覆盖的比例尺，后面会通过设置不同过滤条件去除，故不用担心。

Step.4 填充细胞空隙。依次按照以下顺序 Process→Binary→Fill holes。

Step.5 打断细胞重叠的部分。依次按照以下顺序 Process -> Binary -> Watershed。

Step.6 最小细胞面积计算。依次按照以下顺序 魔法棒工具 -> 选中最小细胞-> Analyze -> Measure（“Area”列即为计算的面积）。选最小细胞时应选择确定是细胞的点，并同时选择多个点进行测量（选择最小的面积进行后续的操作）。这一步的目的寻找最小细胞的尺寸，从而减少背景杂质的影响，并为Step.7做准备。PS小技巧：按住Ctrl，滑动滚轮即可放大图片。

Step.7 自动分析、计数颗粒。依次按照以下顺序 Analyze -> Analyze Particles-> Analyze -> 调整面积过滤及圆形过滤 -> OK -> 输出的count列即为所标记的颗粒数量。

PS：勾选Display results显示结果，Exclude on edges排除在画面边缘的粒子；面积过滤根据Step.6获得的最小细胞进行修改，这里是以791-Infinty为阈值进行修改。

但是此时比例尺也被计算在内，故需要将比例尺去除，因此我们可以选用圆度过滤，circularity阈值为0.2-1间进行过滤，过滤完效果如下图，可见标尺已不算在计数的粒子内。

3 荧光染色图片批量计数

Step.1 把record记录下来的操作步骤复制到记事本。基于“1 批量计数-宏记录创建”节创建的宏记录，在完整完成上述步骤以后，宏记录会获得以下代码信息，此时需要将这代码信息复制到记事本中。

Step.2 开始批量处理。依次按以下顺序进行操作Process -> Batch -> Macro -> 更改Input与output路径（两个路径尽量不要一致） -> 更改输出图片格式 -> Process细胞自动分析  

Count列即为批量处理的标记颗粒数

以下为批量处理的输出图片

好了本次分享就到这里，下期有更精彩内容，敬请期待。

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