【生信刺客】11分的WGCNA+网络药理学+分子对接+体内外实验

WGCNA+网药+分子对接+体外实验

提到网络药理学，许多人首先会联想到它在中医药领域的应用，但事实上，这种高效的生物信息学方法在多种研究领域都展示出了广泛的适用性。今天要分享的是一篇发表在《British Journal of Dermatology》（影响因子11.0）的研究文章。该研究创新性地整合了WGCNA、网络药理学和分子对接三大生信分析工具，并结合体内外实验，系统地探究了增生性瘢痕的分子机制。

题目：利用网络药理学发现治疗增生性疤痕的潜在药物

杂志：BRITISH JOURNAL OF DERMATOLOGY

影响因子：IF=11

中科院分区：医学一区

发表时间：2024年5月

PART·1 研究背景

创伤、手术、烧伤和虫咬可能会导致皮肤损伤，并引起称为“增生性”瘢痕的厚而凸起的瘢痕。每年约有1亿发达国家的人受到瘢痕问题的困扰。增生性瘢痕可能会带来美容和功能上的问题，并影响人们的生活质量。大多数治疗方法未能带来满意的效果。进一步研究增生性瘢痕的形成机制，以改善治疗效果是必要的。

PART·2 方法学

加权基因共表达网络分析

来自NCBI基因表达综合数据库（GEO DataSet）的增生性瘢痕转录组数据（系列GSE122891、GSE188952和GSE178562）用于本研究。本研究仅包括人类增生性瘢痕成纤维细胞（HSF）样本（n = 10）和人类正常瘢痕成纤维细胞样本（n = 5）。使用R语言的'Sva'和'Limma'包进行了批次校正。通过R包'WGCNA'，计算了模块特征基因、基因显著性（GS）、模块显著性和模块成员关系。结果显示，黑色模块与增生性瘢痕显著正相关，而青色、蓝色、皇家蓝、松石色和浅青色模块则与增生性瘢痕显著负相关。

GO和KEGG富集分析

利用R包'clusterProfiler'、'enrichplot'和'ggplot2'以及DAVID生物信息学数据库，进行基因本体论（GO）和京都基因和基因组百科全书（KEGG）富集分析。

蛋白质-蛋白质相互作用网络分析

从黑色模块中选择了GS最高的150个基因，并从青色、蓝色、皇家蓝、松石色和浅青色模块中选择了另一组GS最高的150个基因。为了构建蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）网络，使用了STRING数据库，并将最低交互分数设置为0.7。

利用Connectivity Map数据库进行药物预测

将用于PPI分析的300个基因提交至Connectivity Map（CMAP）数据库（https://clue.io），选择了最显著的50种药物作为增生性瘢痕的候选药物。药物靶点预测是通过DrugBank和SwissTargetPrediction数据库（http://www.swisstargetprediction.ch）进行的。

分子对接

PPI分析表明，ITGB1是增生性瘢痕的枢纽蛋白。ITGB1的蛋白质结构从蛋白质数据库中获取。50种候选药物的分子结构从CMAP数据库中下载。使用PyMOL 2.5.2（https://pymol.org）准备受体蛋白并可视化对接过程的结果。分子对接工作使用AutoDock Vina 1.1.2进行。对接能量表示分子结合过程中吸收或释放的能量，用于评估分子对接的亲和力和稳定性。

试剂

Crizotinib、enzastaurin、linsitinib、momelotinib、sorafenib、SU11274、tacrolimus和TAS-301由Selleck Chemicals（休斯顿，美国）提供。每种化合物均使用100%二甲基亚砜（DMSO）作为溶剂制备成10 mmol L–1的溶液。小鼠ITGB1 siRNA由清科生物科技（北京，中国）合成，RNA序列为：5'-GUGAAGACAUGGACGCUUATT-3'（正向）和5'-UAAGCGUCCAUGUCUUCACTT-3'（反向）。

细胞培养

人类HSF样本取自在中国医学科学院整形外科医院和北京协和医学院接受瘢痕切除手术的患者。细胞在高糖HyClone Dulbecco改良的Eagle培养基（SH30021.01；Cytiva，美国马萨诸塞州马尔伯勒）中培养，培养基中添加了10%胎牛血清和1%青霉素。培养在湿润环境（5% CO₂，37°C）下进行。使用了第3代的原代成纤维细胞。

实时聚合酶链反应

HSFs在六孔板中培养，处理前24小时进行血清饥饿。分别用10 µmol L–1的crizotinib、sorafenib、SU11274或1% DMSO处理1、3和7天。使用Trizol试剂裂解细胞，通过NanoDrop 2000测量RNA浓度和纯度，使用PrimeScript™ RT试剂盒反转录为cDNA。PCR引物靶向COL1A1、ACTA2、TGF-β1、ITGB1和DCN，qPCR分析使用LightCycler® 480，基因表达量相对于GAPDH进行比较，并以对照组的倍数变化呈现。

伤口愈合实验

HSF细胞在六孔板中培养至90-100%融合，处理前24小时进行血清饥饿。用200 μL移液枪头在细胞层上划痕，伤口分别用1%、5%或10 µmol L–1的crizotinib、sorafenib、SU11274或1% DMSO处理3天。划痕后0、24、48和72小时在显微镜下拍摄各组的细胞迁移图像，用ImageJ（NIH，美国马里兰州贝塞斯达）测量伤口区域。

CCK8细胞增殖实验

细胞接种于96孔板中，细胞浓度调整至5 × 10^4 cells mL–1，使用血球计数器计数。处理前24小时进行血清饥饿，HSF细胞用1、5或10 µmol L–1的crizotinib、sorafenib或SU11274处理，DMSO 1%处理的HSF细胞和正常成纤维细胞作为对照。处理后，细胞分别孵育24、48和72小时。随后加入CCK8试剂（碧云天生物技术，中国上海）并在22°C下孵育1小时，用EnSpireTM多功能酶标仪（PerkinElmer，美国康涅狄格州Shelton）在450 nm测量吸光度。

Western Blot

HSF细胞在六孔板中培养，处理前24小时进行血清饥饿。用10 µmol L–1的crizotinib、sorafenib、SU11274或1% DMSO处理3天。使用细胞裂解缓冲液（碧云天生物技术）裂解细胞，并用BCA蛋白定量试剂盒测定蛋白浓度。20 μg蛋白通过8%聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，并转移至0.45 μm聚偏二氟乙烯膜。所用的一抗包括α-SMA、TGF-β1、ITGB1、COL1A1和甘油醛-3-磷酸脱氢酶（Abcam和Solarbio）。使用ChemiDocTM XRS+系统（Bio-Rad，美国加利福尼亚州赫克莱斯）检测免疫反应条带，ImageJ（NIH）用于定量分析。所有蛋白数据均以对照组的倍数变化表示。

小鼠实验

从北京维通利华获取6周龄雌性C57BL/6小鼠，标准条件饲养。采用已发表方案建立机械力增生性瘢痕模型，并用3D打印制造机械加载装置。每只小鼠背部中线做2厘米切口，4天后拆线并安装加载装置。从第4天起，每隔一天拉伸螺钉2 mm，至第14天结束。拉伸期间，实验组每天皮下注射25 mg kg–1的crizotinib、sorafenib或SU11274，或每隔一天注射5 nmol/20 g siRNA；对照组注射0.3 mL的1% DMSO。14天后处死小鼠，拍摄瘢痕照片，切片染色并用ImageJ量化瘢痕区域。

统计分析

使用ANOVA和重复测量混合效应模型分析数据，结果以平均值（SEM）表示，P值<0.05视为显著差异。体外实验每组包含3个样本，每个样本重复3次。体内实验每组包含3只小鼠。

PART·3 分析结果

加权基因共表达网络分析揭示了与肥厚性瘢痕密切相关的关键基因模块

方法：利用WGCNA分析了10个肥厚性瘢痕和5个正常瘢痕样本，确定出6个与肥厚性瘢痕密切相关的显著基因模块。

结果：不同的基因模块与特定生物过程关联。黑色模块中的基因参与黏附连接和能量代谢；青色模块涉及肌动蛋白细胞骨架调控、Ras信号通路和细胞因子受体活性；蓝色模块与细胞黏附、紧密连接、ECM受体相互作用、Rap1信号通路及细胞骨架结构成分相关；皇家蓝模块中的基因关联于钙信号通路、Wnt信号通路及皮肤表皮结构成分；绿松石色模块参与细胞代谢和TGF-β信号通路；浅青色模块则与过氧化物酶体和氧化还原酶活性有关。

图1加权基因共表达网络以及肥厚性疤痕的分析，以及基因本体（GO）/京都基因与基因组百科全书（KEGG）富集分析    

通过连接图数据库和分子对接分析，筛选出潜在治疗增生性瘢痕的药物

方法：分析了6个显著基因模块中的300个重要基因，确定ITGB1为关键蛋白。随后，将这300个基因提交至CMAP数据库进行药物筛选，并通过蛋白质-分子对接分析筛选出9种潜在药物。

结果：通过qPCR实验验证，crizotinib、sorafenib和SU11274能够显著降低肥厚性疤痕成纤维细胞中相关基因的表达，因此被选为治疗肥厚性疤痕的潜在药物。

图2治疗增生性瘢痕的潜在药物的分子对接与实时定量聚合酶链式反应（qPCR）分析    

克里唑替尼、索拉非尼和SU11274在体外显著降低了增生性瘢痕成纤维细胞的迁移能力

方法：通过使用不同浓度的crizotinib、sorafenib和SU11274进行创伤愈合实验，评估这三种药物对HSF迁移的影响。

结果：所有三种药物处理组的创伤愈合速度显著低于对照组，表明这些药物能够显著抑制HSF的迁移能力。

图3克里唑替尼、索拉非尼和SU11274在体外以剂量依赖的方式显著降低了增生性瘢痕成纤维细胞（HSFs）的迁移能力

克里唑替尼、索拉非尼和SU11274能够抑制增生性瘢痕成纤维细胞的增殖，并下调与纤维化相关的蛋白表达

方法：测试了crizotinib、sorafenib和SU11274对HSF增殖的影响，并评估了它们在不同浓度下对正常成纤维细胞增殖的作用。

结果：在较高浓度下，这些药物显著抑制了HSFs的增殖，并使其增殖指数降至接近正常成纤维细胞的水平。Crizotinib显著降低了多个纤维化相关蛋白的表达，而sorafenib和SU11274则主要降低了α-SMA和COL1A1的水平。

图4克里唑替尼、索拉非尼和SU11274能够抑制增生性瘢痕成纤维细胞的增殖，并下调与纤维化相关的蛋白表达

克里唑替尼和整合素β1小干扰RNA（siRNA）能够减轻小鼠增生性瘢痕的形成

方法：在小鼠机械力肥厚性疤痕模型中，皮下注射三种候选药物，并使用ITGB1 siRNA验证ITGB1的功能。

结果：与对照组相比，经crizotinib、sorafenib、SU11274和ITGB1 siRNA处理的小鼠疤痕面积显著减少。Crizotinib和sorafenib的抑制效果优于SU11274，且crizotinib的效果在统计学上优于sorafenib和SU11274。此外，ITGB1 siRNA也能减轻小鼠的疤痕形成。

图5克里唑替尼在体内能够更有效地减轻瘢痕肥大

靶标预测表明克里唑替尼可能影响肥厚性疤痕的信号通路

方法：在小鼠机械力肥厚性疤痕模型中，皮下注射三种候选药物，并使用ITGB1 siRNA验证ITGB1的功能。

结果：与对照组相比，经crizotinib、sorafenib、SU11274和ITGB1 siRNA处理的小鼠疤痕面积显著减少。Crizotinib和sorafenib的抑制效果优于SU11274，且crizotinib的效果在统计学上优于sorafenib和SU11274。此外，ITGB1 siRNA也能减轻小鼠的疤痕形成。

图6预测的克里唑替尼药理学靶标可能影响肥厚性疤痕的信号通路

PART·4 讨论

增生性瘢痕是一种由慢性炎症、异常ECM沉积和肌成纤维细胞积聚引起的疾病，目前治疗效果有限。通过网络药理学（WGCNA）分析与增生性瘢痕相关的基因模块，并结合分子对接，筛选出克里唑替尼作为潜在治疗药物。克里唑替尼在体内外实验中有效减轻增生性瘢痕，可能通过影响TGF-β、MAPK、PI3K/Akt等信号通路发挥作用。该药物具有抗纤维化效果，并可能成为治疗增生性瘢痕的新型药物，但仍需进一步研究其机制和安全性。

PART·5 小优结语

总体来说，本研究通过加权基因共表达网络分析（WGCNA）识别了与肥厚性疤痕相关的基因模块，并确定整合素β1（ITGB1）为核心蛋白。通过计算机分子对接，利用Connectivity Map数据库筛选出治疗肥厚性疤痕的潜在药物，并发现克唑替尼能够通过调控TGF-β信号通路和ITGB1，减轻疤痕形成，具备作为治疗肥厚性疤痕的潜力。实际上，选题对研究至关重要，这篇文章深入探讨了增生性瘢痕的分子机制，并筛选了有效的治疗药物，展示了从关键基因筛选到候选药物筛选，再到实验验证药物功效和机制的完整研究过程，具有良好的逻辑性。

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