易基因：Cell子刊/IF14：表观基因组-微生物组轴揭示肠道菌群的宿主调控｜深度综述

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肠道菌群（gut microbiome）是影响宿主基因表达的表观遗传效应因子。最近的研究表明，宿主能够通过表观遗传变化影响其肠道菌群，包括影响免疫基因的宿主基因表达、肠道屏障功能以及通过非编码RNA的组蛋白和DNA修饰。对宿主生物的表观遗传修饰与其相关肠道菌群构成或活性之间的动态互作研究表明，宿主有机会通过导致基因表达和非编码RNA活性变化的表观遗传改变来塑造其微生物组。本文利用微生物组诱导的表观遗传变化，综述了宿主表观遗传调控其肠道菌群的潜力，从而形成双向“表观基因组-微生物组轴”。此轴加入了环境诱导的变异，可能会影响宿主-微生物互作的适应性进化。最后提出如何在全基因组范围内理解和研究表观基因组-微生物组轴，以及表观基因组-微生物组轴在健康和食品科学中的潜在应用。

肠道菌群的宿主调控

居住在动物胃肠道中的肠道菌群与宿主共同进化了数百万年，塑造了共生体(holobiont)之间错综复杂的关系。虽然肠道菌群对宿主生理（代谢、免疫功能和行为）作用正在被越来越详细地理解，但关于宿主如何积极参与影响其微生物组的了解还相对较少。人类肠道菌群与饮食、生活方式、年龄、性别和遗传背景有关，表明一些宿主因子参与微生物组构成。随着宿主-微生物互作分子和细胞通路的研究越来越多，人们越来越认识到宿主和其微生物组之间可以互作。这种互作使宿主能够调控其肠道菌群的一部分，可能有助于维持肠道稳态，同时也能选择影响适应性特征的微生物特征，如宿主生长、繁殖或疾病抗性，最终影响共生关系进化。

比较系统发育学揭示宿主基因型可能选择某些肠道微生物，全基因组关联研究鉴定出与微生物组构成相关的遗传变异——宿主-微生物在长期（进化）的共同进化。在某些物种中，这种宿主基因型过滤被影响微生物组构成的环境因素所掩盖。然而，即使在遗传上相似的个体暴露于相同的环境条件下，也存在肠道菌群差异，这可能涉及表观遗传变异。

最近宿主表型与相关肠道菌群的动态互作示例表明，宿主有可能通过表观遗传变化和基因表达变化来塑造其微生物组，而无需改变潜在的遗传密码。根据这种表观遗传变化的遗传方式和程度，将允许宿主对影响肠道环境和菌群构成或活性因子变化做出适应性相应。由此引入表观基因组-微生物组轴概念，强调宿主表观基因组对其微生物组的复杂调控。

首先，提供了宿主微生物组诱导的表观遗传变化概述。

接下来，引入宿主通过表观遗传反馈机制调控其微生物组构成和活性的新视角，以响应如环境或微生物线索（图1）。认识到表观基因组-微生物组轴的双向性，进而促进理解宿主-微生物互作及其（共同）进化。

最后，概述实验框架，说明宿主如何主动修饰表观基因组以塑造应用健康和食品科学中微生物组诱导的表型。

图1：宿主表型受表观基因组-微生物组轴影响。

微生物组诱导宿主表观遗传变化

对微生物组诱导的宿主表观基因组变化研究阐明了表观基因组和微生物组互作的潜在机制（图2），尤其在致病背景下。微生物代谢物（如短链脂肪酸,SCFA）和蛋白质（如毒力因子）可以作为表观遗传效应因子，通过肠上皮界面影响宿主的基因表达和表观遗传编程。肠上皮由各种各样的肠上皮细胞（IEC）组成，与粘液层共同作为宿主-肠道微生物互作的第一物理线，并将微生物信号传递给宿主。微生物引起的表观遗传变化包括DNA和组蛋白修饰、染色质可及性和非编码RNA（ncRNA）活性。这些表观遗传变化可以改变宿主的转录环境，特别是在IEC中，从而影响不同的分子和细胞响应以及信号通路。

图2：全基因组表观基因组-微生物组轴。

短链脂肪酸（SCFAs）是研究得最深入的微生物代谢产物之一，SCFAs在宿主生理中起着至关重要的作用，包括通过DNA甲基化和组蛋白修饰影响表观基因组。SCFAs包括丁酸、乙酸和丙酸，通常由肠道微生物发酵多糖产生。SCFAs是宿主组蛋白去乙酰化酶（HDACs）的重要抑制剂，HDACs可以去除组蛋白赖氨酸乙酰基团，导致染色质凝缩和转录沉默（图3）。SCFAs还可以影响组蛋白去克罗酰化和酰化，并为组蛋白乙酰转移酶（HATs）提供供体底物。TET酶对DNA去甲基化至关重要，SCFAs可以影响TET酶活性，如果靶向基因启动子，通常会增加基因转录。其他微生物产物（B族维生素、叶酸和蛋氨酸等），通过生成S-腺苷甲硫氨酸（SAM），作为DNA甲基转移酶（DNMTs）和组蛋白甲基转移酶（HMTs）的底物，充当甲基和乙酰供体。一些研究发现微生物组介导的全基因组DNA甲基化（即甲基化组）和IECs（肠上皮细胞）中组蛋白乙酰化水平变化。

图3：宿主表观基因组和肠道菌群之间互作的潜在机制。

在慢性炎症性肠病（IBD）患者与健康对照组之间观察到全基因组DNA甲基化的显著差异，包括宿主抗菌基因表达增加，这与在小鼠（Mus musculus）中观察到的情况相似。此外，某些以肠杆菌科和拟杆菌属成员为主的微生物组与免疫相关标记的甲基化变化和细胞因子产生增加有关。在无菌斑马鱼（Danio rerio）幼虫中，未表征共生菌（实验室自然发生）的定植通过染色质修饰诱导促炎和抗病毒基因表达。

非编码RNA（ncRNA）参与转录和转录后水平的基因表达调控。microRNA（miRNA）和长链非编码RNA（lncRNA）对不同肠道菌群和微生物代谢产物的响应中表现出差异表达，这在无菌、单菌群定植和常规饲养的小鼠中都有观察到。尽管这种调控机制尚不清楚，但ncRNA正成为宿主对多微生物组相关病理响应（如肥胖和癌症）的重要调控因子。外膜囊泡中包含的细菌 ncRNA 也是宿主表观基因组的调控因子。此外，饮食中的ncRNA可以影响肠道菌群和宿主基因表达。

微生物组衍生配体可以影响转录因子结合（如抑制宿主对炎症的基因调控应答）。Davison等人发现斑马鱼微生物组抑制转录因子肝细胞核因子4（HNF4）的结合，HNF4调控胆汁酸产生，可能导致IBD发展。此外，饮食成分可以调控微生物代谢和微生物组诱导的表观遗传变化的底物可用性，从而影响宿主健康。然而，大多数微生物代谢产物对宿主表观基因组组的影响尚未得到验证。

肠道菌群的宿主表观遗传调控

越来越多的证据揭示理解宿主表观遗传因子如何构建微生物组构成的重要性。然而，很难理清宿主表观遗传学、基因表达和微生物组相关性的潜在因果关系。例如Schaible等人表明，富含甲基供体的饮食可以同时诱导小鼠特定位点的宿主DNA甲基化和肠道菌群变化，但没有进一步探索因果关系。然而，实验研究表明宿主表观遗传学和基因表达的差异可以导致微生物组变化，揭示了宿主-微生物互作的双向轴。

这些实验研究揭示一系列对微生物组有影响的宿主蛋白。Alenghat等人证明，在IECs（肠上皮细胞）中去除组蛋白去乙酰化酶3（HDAC3）的小鼠敲除模型中，表现出抗菌基因表达减少、肠道屏障功能丧失以及肠道菌群构成变化，其中变形菌门（Proteobacteria）水平增加，表明影响微生物组反馈信号包括宿主表观遗传和转录通路的协调响应。IECs中HDACs表达调控淋巴细胞活性和抗菌肽（AMPs）产生，作为对细菌感染的免疫响应，可以维持肠道屏障功能（图3）。Eshleman等人揭示了微生物产生的丁酸在小鼠和小肠类器官中抑制IECs中HDAC3的反馈回路。HDAC3抑制阻碍了上皮（簇状）细胞发育，破坏对蠕虫病原体感染的下游免疫细胞和细胞因子响应。几种sirtuin蛋白也去乙酰化组蛋白，如肠道中SIRT1缺失小鼠显示出肠道菌群变化，导致肠道炎症增加或减少，需要进一步探索SIRT1和HDAC3等基因是否通过组蛋白去乙酰化或替代机制与微生物组互作。在果蝇（Drosophila melanogaster）中，敲除染色质重塑因子CHD1会增加肠道中AMPs表达，并导致肠道屏障功能受损，结果出现菌群失调。类似实验中，敲除转录调控免疫基因的组蛋白去甲基化酶KDM5，也导致肠道屏障功能障碍和菌群失调。在小鼠中，敲除染色质reader蛋白斑点蛋白140（SP140）导致了菌群失调和AMP表达失调。

肠道衍生的免疫系统分子（包括AMPs、细胞因子和分泌性免疫球蛋白）是真核宿主先天免疫响应和防御病原体的重要组成部分，其可以促进共生微生物的耐受性，从而维持肠道稳态。AMPs通常专门靶向微生物膜，以破坏、包裹或穿透，导致抑制或杀死细菌、真菌或包膜病毒。AMPs还激活免疫细胞并刺激细胞因子产生（图3），宿主对AMPs、抗炎细胞因子和免疫球蛋白抗体的表达可以响应微生物抗原，但也可以响应SCFA产生，如丰富的免疫球蛋白A结合到细菌表面的特定抗原上，实现调控性覆盖。这些宿主衍生分子因此直接调控微生物组多样性和丰度，可能是许多观察到但尚未表征的宿主表观遗传变化和肠道菌群之间关联的基础。

其他例子显示外源性应激如何通过宿主基因组的表观遗传变化影响微生物组。Cortese等人用糖皮质激素处理怀孕小鼠，改变了DNA甲基化，导致调节肠道屏障功能的紧密连接和Toll样受体相关通路的基因表达变化，进而介导后代微生物组变化。Hansen等人揭示致病性皮肤感染诱导大西洋鲑鱼（Salmo salar）肠道组织DNA甲基化差异，从而影响肠道菌群构成。研究还表明同一水箱中健康鱼的微生物组保持稳定，表明病鱼中的微生物组变化由与免疫功能和粘液分泌相关的宿主表观遗传响应引起。此外，Brealey等人表明，与鲑鱼肠道绦虫感染相关的细菌定植与鲑鱼基因组中几个lncRNAs的遗传变异强相关。这些lncRNAs可能通过调控基因表达或免疫应答参与宿主对肠道菌群调控。

Liu等人发现，宿主衍生的miRNAs可以从IECs中以细胞外囊泡（外泌体）形式释放到肠道腔中，进入细菌后直接干扰微生物的基因表达和生长。此外，粪便miRNA移植恢复了IEC特异性敲除miRNA处理酶Dicer的失调小鼠的肠道菌群。与AMPs或免疫活性的表观遗传调控相比，ncRNAs允许宿主通过靶向特定细菌和基因转录本直接以高特异性调控微生物组。多个ncRNAs也调控肠道屏障，如通过与紧密连接蛋白的表达互作用（在IBD患者中观察到）。

表观基因组-微生物组轴是否介导共生体特征的快速适应性进化？

表观基因组构成微生物组与宿主基因表达之间的动态界面，可以作为对环境变化或病原体内在生理响应的感应因子或触发因子。宿主表观基因组和其微生物组都加入了环境诱导的变异，并且可能对外源性应激源做出快速响应。如在鸡（Gallus gallus）身上进行的关于体重差异的人工选择导致与微生物组相关的差异甲基化、基因表达和miRNA谱，表明鸡的表观基因组和微生物组的联合适应性响应。利用最新测序技术进展，范围可以扩展到包括宏基因组的表观遗传修饰，即共生体表观基因组。微生物组可以被视为具有对宿主表型短暂和跨代表观遗传效应的“表观遗传现象”。微生物组介导基因-环境互作能力表明其是适应性变异来源。提高对这些非遗传因子（微生物组和表观基因组）对表型可塑性和适应潜力贡献的认识，将改善对宿主-微生物关系（共同）进化以及一般适应性进化的理解。

微生物组影响宿主的适应性，但在不同物种间的影响程度不同。此外微生物组和宿主表观基因组的跨代遗传大小和模式在不同物种间尚不清楚，并且很少有一般性模式被描述。但人们越来越认识到，进化不仅通过宿主基因组的变化发生，还通过宏基因组和微生物组变化发生。此外，表观遗传变化可能在驱动表型可塑性、影响突变率从而影响基因组进化，以及潜在地印记过去的微生物接触中发挥重要作用。表观基因组-微生物组轴的实现表明，宿主-微生物组互作有可能在宿主中诱导表观遗传变化，这些变化可能影响微生物特征的快速适应，从而影响宿主对环境变化的适应性。

表观基因组-微生物组轴的新兴技术

生物技术的发展为实验性地检测表观基因组-微生物组轴的潜在机制提供巨大潜力。截至目前，无菌或定植动物模型已被用来有效地推断微生物组对宿主表观基因组的影响。然而，宿主通过表观遗传变化直接和可逆地调控其微生物组构成和活性的潜力在表观遗传学的实验研究中很少被探索。

CRISPR/Cas系统可以简单使用小的导向RNA（gRNA）来定位特定DNA位点，Cas核酸酶可以在这些位点切割DNA链，以引入突变或插入。切割后依赖复杂的内源性DNA修复机制是脱靶效应的一个关注点。在Cas蛋白的两个核酸酶域引入突变，可以创建催化失活（dCas）版本，利用CRISPR系统的特异性而不修饰DNA序列。将dCas与各种表观遗传效应子（基因调控蛋白，例如DNMTs或HMTs）融合，允许通过如DNA（去）甲基化或组蛋白（去）乙酰化来降低或增加转录。该融合蛋白（或编码该蛋白的mRNA）可以与一个或多个gRNA结合注入细胞或胚胎，允许通过靶向基因启动子等位点特异性DNA甲基化来稳定（有丝分裂遗传）但可逆地编程基因表达，从而直接分析微生物组中特定位点的表观遗传变化的功能和因果关系（图4）。

图4：使用表观遗传工程操纵微生物特性

全基因组利用CRISPR/Cas技术研究宿主基因对微生物组的影响，可以通过表观遗传工程进一步扩展。然而，主要挑战包括为不同物种和组织中的不同表观遗传机制优化dCas结构体。此外，识别对微生物组有重大影响的一个或几个候选基因、位点和表达模式，或开发用于探测表观遗传组中许多位点的表观遗传筛选，是尚未解决的任务。

CRISPR/dCas系统的多功能性和可行性设计选择意味着其正在超越其他表观遗传工程工具，包括锌指蛋白和转录激活因子样效应子阵列。基于Morpholino基因沉默，暂时阻断靶向mRNAs翻译，不会导致可遗传的表观遗传突变，但可能在特定的发育时间点诱导持久的基因表达变化。也有可能采用更简单但高通量的方法，如热处理、饮食或其他生理化学变化，来刺激（表观遗传和微生物组之间的）相互作用。这些方法可以用来研究早期生活中的肠道发育和微生物定植。

Yang等人最近创建了转基因小鼠，以诱导双链DNA断裂和最小突变的修复，加速衰老过程，包括增加基于DNA甲基化的表观遗传年龄和染色质状态重塑。尽管需要遗传改造，但这个实验模型重现了衰老过程中观察到的表观遗传失调，因此可以用来揭示将表观基因组和微生物组变化与年龄联系起来的功能通路。衰老研究可能代表未被探索的资源，用于探索这两个潜在相互联系的衰老标志如何互作。

这些实验技术必须与技术相结合，以解决全基因组范围内的甲基化组、组蛋白修饰和染色质组织，以及各种ncRNA分析方法。然而，解决一种或几种类型的表观遗传修饰通常不足以阐明完整的表观遗传组-转录组-蛋白质组-代谢组谱（图2），表明需要综合的全基因组方法。以前的微生物组研究使用16S核糖体RNA进行微生物分析，仅限于对微生物组构成的描述性特征，对微生物组功能理解有限。然而，非靶向宏基因组学和新的靶向测序方法可以提供改进的宿主-微生物互作的机制视角。与侧重于特定基因和分类群的扩增子测序方法不同，宏基因组学提供了宏基因组的全面描述。重建宏基因组组装的基因组可以更深入地分析微生物的分类、遗传和代谢多样性。结合宏转录组学、非靶向（宏）代谢组学和高通量细菌培养组学，为宿主-微生物组关联提供详细的功能解释。

利用表观基因组-微生物组轴改善健康和畜牧业生产

通过益生元、益生菌和抗生素或粪便微生物移植来修饰微生物组的一般方法，可能由于个体在（表观）基因型上的差异以及缺乏靶向特定微生物特征的目标而效率不高。与其靶向微生物组，不如靶向宿主微生物组调控机制，可能为预防或治疗微生物组引起的疾病或由于表观遗传失调引起的菌群失调提供新的精准医疗。大多数表观遗传变化可逆，使其成为（化学）治疗干预和个性化医疗的有趣目标。靶向表观遗传修饰的药物（表观药物），如通过抑制DNA甲基转移酶（DNMTs，如阿扎胞苷及其衍生物地西他滨）或组蛋白去乙酰化酶（HDACs，如罗米地新）已在某些癌症治疗中使用。与能够诱导特定（潜在可遗传）表观遗传突变的CRISPR/dCas工具相比，表观药物是广泛调控表观基因组-微生物组轴的候选药物，表观遗传工程也可以考虑用于临床目标，靶向微生物组失调介导的胃肠道疾病，DNA甲基化差异经常介导遗传易感性。这类疾病包括炎症性肠病和坏死性小肠结肠炎，代谢性疾病如糖尿病和肥胖，神经系统、自身免疫和炎症性疾病，结直肠癌和胃癌，早期干预可能特别有效。但在畜牧业和野生动物中，缺乏对表观基因组-微生物组互作的认识和研究。表观遗传工程可能作为一种新颖的替代方法，用于改善与生产动物生长、生存和减轻压力相关的有益微生物特征（图4）。

结论和未来展望

肠道菌群是影响宿主基因表达的表观遗传效应因子。然而，宿主也能够通过例如影响免疫基因、抗菌肽（AMPs）或肠道屏障功能的组蛋白和DNA修饰来影响肠道菌群，并通过可能影响微生物基因表达的非编码RNA（ncRNAs）（图3）。然而，关于宿主衍生代谢物如何影响微生物组的知识还很少，许多瞬时产生的ncRNAs功能尚不清楚，表明未来研究重点应放在综合宿主-微生物组互作的功能双向通路上，这些通路是宿主调控肠道菌群的基础。

一些研究表明，宿主对肠道菌群动态（可逆）表观遗传调控的重要组分通过调控与肠道屏障保护相关的基因或通路来实现。除了营养转运，肠道屏障在病原体防御和维持健康肠道菌群的稳态中至关重要。此外，菌群失调可以导致或由肠道屏障完整性破坏引起炎症。阐明宿主对感染的表观遗传应答和肠道屏障通透性的表观遗传调控预示研究表观基因组-微生物组轴的重要性。大多数当前研究限于无菌、定植、敲除、移植或用抗生素处理的实验室动物模型，对于在养殖或自然条件下的大型、非近交动物，包括人类表观基因组-微生物组互作知之甚少。此外由于大多数研究集中在肠道菌群的细菌成分上，宿主表观基因组如何与病毒组和真菌组，或其他组织的微生物组互作，也基本未知。因此建议通过双向表观基因组-微生物组轴的视角重新审视全生物体生理学，包括微生物特征与宿主健康之间的关联，引发一些新的研究问题和机会。

关于易基因三代原核甲基化纳米孔测序(ONT)

表观修饰不需要改变DNA序列便能实现对性状的改变，表观修饰的改变与基因功能乃至细胞状态、发育、衰老、疾病等存在重要的关联。在众多的表观遗传修饰中，最为重要且研究最为广泛的修饰之一是DNA甲基化。

由于PCR的扩增过程会消除碱基修饰信息，通过传统测序技术对其进行检测需要使用特殊的文库制备步骤，从而造成核酸损坏，最终导致测序读长序列非常短。

Nanopore测序是Oxford Nanopore Technologies(ONT)公司开发的基于纳米孔电信号的单分子实时测序技术，DNA双链在马达蛋白的作用下与锚定在生物膜上的八聚体纳米孔蛋白结合并解螺旋。由于生物膜两测存在电势差，解旋后的单链DNA以一定速率通过纳米孔。由于化学性质不同，不同碱基通过纳米孔时，会引起不同电信号的变化。通过对这些电信号变化进行检测和解析，完成序列的实时测定。Nanopore的碱基判读是依据其电流信号而产生，因此其判定过程比较复杂。目前Nanopore根据电流的大小及电流大小的变化情况，通过“递归神经网络（Recurrent Neural Network）”的复杂算法对碱基进行判读。

ONT全基因组甲基化测序原理示意图如下：

技术优势：

长读长：平均读长＞10Kbp，最长可达2M左右，直接跨越重复序列、高度多态性区域等特殊区域；
直接测序：无需PCR扩增，可直接保留并检测DNA甲基化修饰；
全基因组覆盖：可同时检测全基因组范围单碱基的5mC与6mA修饰位点，并给出单碱基的甲基化水平；
性价比高：ONT测序成本相对于二代NGS测序技术大幅降低。

实验策略：

关于易基因宏基因组测序

由于扩增子测序技术关注的是目标基因的若干区域，因此其分辨率有限，一般认为较为准确的分类水平到属级别。虽然扩增子测序也可以通过数据库映射预测群落可能的功能网络，但是微生物遗传片段交流比较频繁，功能基因的横向转移也较为普遍，依托于有限菌株建立的功能映射无法尽可能的还原群落的真实功能网络。全宏基因组测序技术直接对提取的全宏基因组DNA建立随机小片段文库，能够获取更多的序列信息。通过组装、ORFs预测与注释，可以大大提高分类水平部分至菌株级别，并通过各种大型公共数据库进行相应功能注释，尽可能真实的获取群落功能网络信息。高精度的分析结果也使相关动物验证实验更加具备可行性。

易基因提供全面的表观基因组学（DNA甲基化、DNA羟甲基化）和表观转录组学（m6A、m5C、m1A、m7G、ac4C）、染色质结构与功能组学技术方案（ChIP-seq、ATAC-seq）、微生物组学（宏病毒组、宏基因组、原核转录组），详询易基因：0755-28317900。

参考文献：

Pepke ML, Hansen SB, Limborg MT. Unraveling host regulation of gut microbiota through the epigenome-microbiome axis. Trends Microbiol. 2024 Jun 4. pii: S0966-842X(24)00137-9. doi: 10.1016/j.tim.2024.05.006. PubMed PMID: 38839511.