共聚焦显微镜针孔效应

　　在操作共聚焦显微镜，或在讨论这种装置的特性和参数时，我们不可避免地提到针孔及其直径。这篇简短的文章是针对那些没有足够时间钻研共聚焦显微镜的理论和细节但又想了解针孔效应的用户们来解释针孔的意义。   

什么是针孔？

　　基于透镜的光学仪器主要涉及两个参数：透镜曲率和直径。曲率决定了平行光线的偏转方向，直径决定了这些光线对结果图像的贡献。直径可以是透镜的外框，在大多情况下，它是一个单独的光圈，决定了了光束直径。普通光阑是由瓣状结构制成的，通过调节瓣状结构可以控制光阑的直径。不过，目前的瓣状结构制造技术无法产生极小的光阑。产生一个极小光阑的最简单的方法是，用针刺穿纸板或铝箔，因此称为针孔。这种针孔是“暗箱照相机”的工作原理 [1]。

共聚焦显微镜中针孔的作用是什么？

　　共聚焦显微镜对样品进行光学切片并做记录，切片刚好覆盖显微镜产生的景深是最理想的情况。

　　为了实现这一操作，样品被逐点扫描。可以产生的最小形状是衍射极限点。显微镜焦平面上形成的衍射极限光斑是点状光源的图像，因此称为“点扩散函数，psf”，用于描述光学设备成像极小光斑时焦点中的光分布情况。由于所有的传统光源通常不是点形的，而是有一个明显的延伸，光源投射在一个小孔（针孔）上作为点形光源。

　　在探测方面，传感器必须遵循相同的方式。也就是说，感测区域也应该是衍射极限点，始终与照明点重合。这可以通过类似设置实现：发射光通过一个微小的光圈，即检测针孔，然后由传感元件记录。当我们在共聚焦显微镜中提到“针孔”时，通常是指这个针孔。

　　术语“共聚焦”指的是这种设置：照明和探测都聚焦在同一个点上[2]typo3/，焦点共轭。像上个世纪电视屏幕上的电子束一样，通过逐点扫描视野来生成图像。扫描通常由一组可旋转的反射镜来完成。

　　如图1[3]所示，检测针孔去除了所有来自非焦平面的发射。因此它也被称为“空间滤波器”，阻断焦外信号。由于这种装置实现了光学切片的效果，所以又称为“光刀”。

　　图1：光刀。a） 复合显微镜通过物镜（obj）产生中间图像（iim），其中包含样品（prp）发出的焦面（红色）和焦外（粉色）信号。当对单个光斑成像时，探测器（det）将记录来自焦平面的光斑信号和来自非焦平面的模糊信号。b） 通过在中间像面引入针孔孔径（ph），几乎所有的焦外信号都被屏蔽，只有焦平面的发射才能到达探测器。空间滤波器行成了光学切片。

为什么针孔直径可变？

　　对于一般共聚焦成像，建议仅通过针孔传输衍射极限信号的中心部分。这个内部部分叫做“艾里斑”。中间图像中艾里斑的大小取决于波长（颜色）、数值孔径NA、物镜的放大倍数和显微镜内部光学系统的放大倍数。NA和物镜放大倍数刻在镜筒上。因此，对于不同颜色和具有不同NA和/或放大倍数的不同物镜，所需的针孔直径不同。

　　图2：针孔直径和衍射图。左侧：红色圆圈表示调整为1 AU的圆形针孔。这个针孔将切割衍射图样的内圈，并产生尺寸为dz的光学切片。AU=“艾里斑”。右图：对于扫描显微镜成像，记录了一系列衍射图样的子集。这些图像被组合起来，显示出更高的横向分辨率（与宽视场相比）。光学切片的性能仍被假定相当于扫描区域，即相当于设置为红环所示尺寸的针孔。

　　此外，可变针孔为用户提供了通过减小直径来增加光学切片锐度或通过增大直径来降低光学切片性能的灵活度。

针孔变大会怎样？

　　如上所述，用于一般共聚焦成像的针孔应刚好通过艾里斑。这种情况下的直径称为“艾里单位，AU”。这是一个理想和现实之间的妥协，而不是源于自然规律。当针孔尺寸增加时，越来越多的焦外信号将到达传感器，并逐渐模糊锐利的焦点信息[4]typo3/。因为整体信号强度增加，信噪比（SNR）似乎有所改善。但是这种增加是由于从焦平面外收集到不需要的模糊信号。如果针孔（实际上）无限放大，就变成一个非共聚焦宽场显微镜（见图3）。因此，一般不建议仅仅为了减少图像的噪声而打开针孔。

　　图3：针孔直径对轴向分辨率的影响。共聚焦显微镜的实际设置是直径为1 AU（灰色垂直线）。当直径增大时，探测器将接收到焦外信号，虽然强度可能增加，但z轴分辨率会变差。对于直径小于1 AU的针孔，截面性能仍会提高，但假设直径为零时衍射极限值有限。

　　横向分辨率不受影响，并且始终保持在同样适用于宽场成像的值，由阿贝公式给出：d=λ/2NA（见图4）。

针孔变小会怎样？

　　当针孔直径为零时，得到轴向衍射极限处的最薄光学切片。当然，这不现实。事实上，衍射极限处的光学切片厚度仅比1 AU时改善25% [4]。

　　除了针孔直径大于1 AU外，当针孔闭合时，横向分辨率也会受到影响。在针孔为零的情况下，可以预期横向分辨率增加约30%。通过关闭略低于建议的1 AU的针孔，可以部分利用这一改进。例如，在0.6 AU时，我们已经将分辨率提高了58%的。为了保证良好的信噪比，我们应该使用一个对发射光利用效率很高的显微镜和几乎无噪声的传感器。

　　图4：针孔直径对横向分辨率的影响。随着直径的增加，1 AU处的横向分辨率是恒定的，与普通的宽场显微镜分辨率（衍射极限分辨率）相对应。当针孔直径小于1 AU时，横向分辨率提高。在针孔直径为零时，分辨率的提升极限约为30%。在针孔直径为0.6 AU时，分辨率的总提升约达60%（红色垂直线）。

这与图像扫描中的psf子集有什么关系？

　　“缩小针孔增加横向扫描分辨率的另一种方法称为“重新扫描typo3/” [5]。这里的衍射图案本身被再次扫描并且分量被重新分配到相邻像素（参见图2，右侧）。通过计算一个新的合成图像，横向分辨率可提高约1.4倍，与宽场显微镜相比，几乎不依赖于等效针孔直径。不过，光学切片性能将假定整个扫描区域的光学切片性能并遵循图3所示的关系。