2023-8-1 显微成像技术的过去，现在和未来

主讲人：徐涛 中科院生物物理所

引入：显微成像技术

• 公元前三十世纪，偶然制作出少量玻璃
• 公元13世纪，设计出放大镜
• 罗伯特·胡克（1635-1703）
  • 使用显微镜首次发现和定义细胞
  • 首次记录植物的形态
• 列文虎克（）
  • 制作出高倍数显微镜
  • 首次记录微生物形态

显微镜技术经过多年的发展，在成像质量，数字化，自动化，智能化 方面都有了巨大的进步

现代显微镜与细胞

“看不到”

• 现代显微镜提供多重成像模式
• 细胞器通常为无色，为了显色需要用标记技术
• \(\rm GFP\)技术：一种具有绿色荧光的蛋白质，激发为蓝光（2008年诺奖化学）标记目标分子实现定位
• 通过荧光染色组分标记特定细胞器，实现细胞内结构可视化（光学显微镜）

光学显微镜技术+荧光标记→细胞微观结构显示

• 脑虹（Brainbow):脑虹是科学家最新发明的有关老鼠大脑神经元的彩色成像图^[1]

  摘要：“脑虹”技术利用GFP等荧光蛋白进行细胞标记，以可视化神经环路。BrainBow是一种用于神经元标记的技术，通过组合不同的FP基因，升级版的BrainBow3.0解决了早期版本光度低问题，并采用了更优的3.1和3.2版本。获取高质量BrainBow图像的指南包括品制和共聚焦激光描微扫显镜，需要避免光污染和荧光串扰，并校正三种或更多颜色。通过后处理以最大化利用色彩信息，可以更详细地观察到各种生物体的单细胞形态和动态，为其与背景区分提供数据和参考。

• 多重颜色荧光蛋白的应用：同时观测不同细胞器的结构和相互作用

• 钙敏感荧光蛋白记录神经元活动：不需要植入电极

• 高灵敏度探测方法：单分子直接成像（实现单分子动态行为的研究），无法看清细微结构

“看不清”

• 光的衍射：距离太近的分子光斑无法分辨限制分辨能力

• 恩斯特·卡尔·阿贝提出

  • 【阿贝极限】光学显微镜分辨率的极限，大约是可见光波长的一半。
  • \(δ=\dfrac{0.61\lambda}{n\sin\alpha}\)
  • 例：绿色荧光着色波长\(\rm 500\ nm\to\)此时最低分辨率为\(\rm 250\ nm\)

• 2014年诺贝尔化学奖授予了白兹格、威廉姆·艾斯科·莫尔纳尔和斯特凡·W·赫尔，以表彰他们发展了超分辨荧光显微镜，并将其应用于生物化学等领域的开创性贡献。

• 单分子定位超分辨显微镜：通过激活光和激发光控制成像区每次仅有少量、随机、离散的单个荧光分子闪烁发光，以时间换空间，再通过高斯拟合分析单个荧光分子点扩展函数中心实现高精度的空间定位，最后将数万张图片进行叠加形成一幅超分辨图像。

  超分辨显微镜技术+荧光标记→细胞精细微观结构显示

• 应用：超分辨率显微镜发现神经细胞轴突上维斯的周期性排列

“立体化”

• 通过二维高斯拟合方法计算图像质心

• 干涉测量术：干涉测量术是通过由波的叠加（通常为电磁波）引起的干涉现象来获取信息的技术，是现有精度最高的长度测量仪器

  

• 干涉测量和单分子测量的矛盾

  	干涉测量	单分子测量
  定义	通过干涉现象获取信息的技术	利用单分子定位技术进行超分辨成像
  基本原理	由波的叠加引起干涉现象	单分子定位技术
  分辨率	高（与干涉仪的设计和制造技术相关）	高（与荧光分子的发亮时间和空间分布相关）
  非侵入性	是（可以在样品周围观察）	是（可以在生物体内进行成像）
  成像速度	较慢（需要多张图片叠加）	快速（可以在毫秒级别完成成像）

• 三维成像：Z轴精度较低；解决方法：\(\rm ROSE-Z\)技术

• 三维成像实现40nm微观结构解析

  超分辨成像+单分子干涉定位→分子的三维结构

未来计划

• 原位电镜成像技术：一种通过在电子显微镜中观察材料的实时行为的方法。它可以允许使用者对材料在不同条件下的行为进行直接观察，例如在受到力、温度和环境变化时。原位电镜技术通常分为两种类型：透射电子显微镜（TEM）和扫描电子显微镜（SEM）。
• 光镜-电镜联用成像技术旨在通过结合光镜的高分辨率和电镜的穿透深度来获得更准确的和全面的样品图像。光镜可以用于定位和引导样品，而TEM则可以提供高分辨率的图像和更深入的细节。