脂质在真核光合生物的叶绿体中建立了特殊的类囊体膜，然而，从其他细胞器向叶绿体传递脂质的分子机制仍需要进一步阐明。在这里，我们揭示了拟南芥Sec14同源蛋白AtSFH5和AtSFH7在从内质网（ER）传递磷脂酸（PA）到叶绿体中的结构基础，以及它们在调控叶绿体脂质组成和类囊体发育中的功能。AtSFH5和AtSFH7定位于ER和叶绿体，它们的缺失导致叶绿体结构异常，叠加的类囊体膜厚度减小。我们证明，AtSFH5能够在体外特异性地识别和传递PA，而酵母和人类Sec14蛋白不能。AtSFH5-Sec14域与L-α-磷脂酸（L-α-PA）和1,2-二棕榈酰-sn-甘油-3-磷酸酯（DPPA）的晶体结构表明，两个PA配体以不同的构型嵌套在中央腔中，阐明了PA与AtSFH5的特异性结合模式，与已报告的磷脂酸乙醇胺（PE）/磷脂酰胆碱（PC）/磷脂酰肌醇（PI）结合模式不同。叶绿体脂质的定量脂质组学分析显示，在AtSFH5和AtSFH7缺乏的情况下，PA和单半乳糖二酰基甘油（MGDG），尤其是MGDG中sn-2位置的C18脂肪酸显著减少，表明ER到质体（叶绿体）脂质转移受到破坏。我们的研究确定了植物SFH蛋白在细胞器之间传递PA的作用，并阐明了其结构基础，提出了一个涉及细胞质体适应性进化的机制，即通过从叶绿体内生蓝藻的内在ER到叶绿体之间的磷脂质体互联运输模型。
太阳能在真核光合生物的类囊体膜中被转化为化学能，而在类囊体膜中适当的脂质组装，特别是来自其他细胞器的脂质前体的转移，至关重要。在所有真核生物中都发现了Sec14同源蛋白，它们能够结合和传递各种各样的脂质。通过结晶拟南芥Sec14同源蛋白5（AtSFH5）的Sec14域以及相关的生化和遗传研究，我们阐明了磷脂酸（PA）的特定结合模式和植物Sec14域的独特结构特征，并证明了AtSFH5和AtSFH7在调控叶绿体发育中的关键作用，为细胞器之间的磷脂质体传输提供了一个模型，以及涉及细胞质体适应性进化的机制。
光能转化为化学势能是地球上维持生命存活所需的能源来源。叶绿体是一种源自蓝藻内共生的双膜细胞器，为光合作用提供了结构基础。类囊体由叶绿体内膜折叠而成，拥有由脂质、酶和色素组装而成的独特膜结构。类囊体膜主要由半乳糖甘油脂质（包括单半乳糖二酰基甘油（MGDG）和双半乳糖二酰基甘油（DGDG））组成，这些脂质建立了特定和功能性膜，是光合复合体的组成部分。从内质网（ER）传递脂质对于类囊体膜的脂质生物合成至关重要，MGDG和DGDG的缺陷生物合成或脂质传递会对类囊体生成和叶绿体发育产生不利影响，导致叶绿素含量减少、叶绿体超微结构异常和光合活性降低。拟南芥三半乳糖二酰基甘油（TGD）机制由TGD1（渗透蛋白）、TGD2（PA结合蛋白）和TGD3（ATP酶）蛋白组成，在从ER到质体的脂质传递或从外包膜和内膜间隙到叶绿体内膜的质膜侧具有关键作用，破坏其中任何TGD成员都会导致来源于ER的类囊体脂质的异常生物合成。
在人类、酵母和植物中已经鉴定出了超过20个脂质转运蛋白（LTP）家族，它们以非囊泡的方式在膜之间传递各种脂质。具有相关进化和淋巴兴趣的蛋白（PRELI）能够在亚细胞间结合和运输磷脂酸（PA）（9）。人类的磷脂酰肌醇转运蛋白家族的RdgB蛋白能够结合和传递PA；特别是RdgBα1/Nir2能够将PA从细胞质膜传递到内质网，同时将PI传递到相反方向（10, 11）。酵母的Ups1-Mdm35蛋白复合物属于PRELI家族，它能够结合线粒体外膜上的PA并将其传递到内膜（12, 13）。然而，目前尚不清楚在植物中哪些LTP能够在细胞器之间传递PA。
Sec14家族在所有真核生物中都有，其特征是具有保守的Sec14结构域，能够在体外结合和传递各种脂质和疏水性维生素（14）。酵母的基因组编码了原型Sec14p和五个Sec14同源蛋白（称为Sfh1p-Sfh5p），它们在脂质代谢和膜运输中展示出不同的生理功能（15）。在人类中有约30个含有Sec14的蛋白质，它们的功能障碍可能会引发一系列疾病，如维生素E缺乏症、常染色体显性癌症和共济失调（14）。所有酵母Sec14蛋白都包含一个Sec14结构域，而大多数人类Sec14成员都是复杂的模块化蛋白质，包括Golgi动态（GOLD）、pleckstrin同源（PH）和蛋白激酶/磷酸酶等额外结构域。在拟南芥中有32个含有Sec14的蛋白，可以分为三个亚家族，即仅含有Sec14的成员（AtPITP1-12）、含有Sec14-GOLD结构域的蛋白（patellins, AtPATL1-6）和植物特有的成员Sec14-Nodulin蛋白（AtSFH1-14）（16）。
磷脂酸（PA）是类囊体膜组装的关键脂质前体，主要在内质网（ER）中合成，随后合成甘油二酰基甘油酯（DAG）、连续的PG-磷酸和磷脂酰甘油（PG）（17），然后在叶绿体的类囊体膜中合成半乳糖甘油脂[MGDG、DGDG和糖基磷脂酰甘油（SQDG）]依赖于PA（18）。研究表明，在拟南芥中，TGD机制参与了从ER到类囊体的脂质转移（4）；然而，PA如何从ER或其他膜结构传递到叶绿体外包膜仍需要进一步理解。通过系统的遗传学、结构学和脂质组学分析，我们在这里对植物细胞中的ER-叶绿体PA传递进行了功能性表征和阐明了其分子基础和重要性。AtSFH5和AtSFH7定位于ER和叶绿体，并且能够在膜之间高效地传递PA。AtSFH5与不同PA配体的晶体结构显示，PA深深地结合在Sec14域的疏水口袋中。PA与AtSFH5的结合模式与已报道的PE/PC/PI结合模式相似，但又有所不同。
拟南芥的AtSFH5和AtSFH7对于光自养生长和叶绿体发育至关重要。为了研究植物特有的SFH蛋白亚家族的功能，我们使用eFP浏览器（http://bar.utoronto.ca/efp_arabidopsis/cgi-bin/efpWeb.cgi）进行了搜索，并选择了具有相似表达模式的AtSFH5和AtSFH7基因。实时定量聚合酶链反应（qPCR）分析显示，AtSFH5和AtSFH7在各种组织中均有转录，并在叶子中高度表达（附录S1，图S1A）。通过观察转基因幼苗的启动子-报告基因（β-葡萄糖醛酸酶，GUS）融合分析，显示AtSFH5和AtSFH7主要在不同发育阶段的子叶和基生叶中表达（附录S1，图S1B），表明AtSFH5和AtSFH7在植物的营养生长过程中发挥作用。
已鉴定出转座子DNA（T-DNA）插入突变体sfh5（SALK_114805C）和sfh7（SALK_113006C）（附录S2A，图S2A）。使用位于T-DNA和环绕基因组DNA的引物进行PCR扩增和qPCR分析，确认了T-DNA插入和AtSFH5以及AtSFH7的转录不足（附录S2B和S2C）。表型观察显示，sfh5或sfh7单突变体没有明显的生长异常，而sfh5 sfh7双突变体呈半侏儒形，具有较小和苍白的绿色基生叶（图1A和附录S3A）。测量结果显示，sfh5 sfh7的叶绿素含量降低（1.04 mg/g，与Columbia-0（Col-0）的1.45 mg/g相比）（图1B），并且一直显著降低非光化学淬灭（NPQ，附录S3B）。进一步的透射电子显微镜（TEM）分析显示，sfh5 sfh7的叶绿体超微结构严重缺陷/未充分发育，尺寸较小，形状较扁平（图1C）。此外，sfh5 sfh7中的类囊体膜叠层明显扭曲，且类囊体膜叠层减少（未观察到高度叠加的类囊体膜），这可能影响了电子传递和叶绿素合成，导致NPQ降低。通过在sfh5 sfh7中使用自身天然启动子驱动AtSFH7的补充表达，结果显示恢复了叶绿体和生长（图1A和附录S3C），进一步证实了AtSFH5和AtSFH7在叶绿体发育和植物的生长中的关键作用。
AtSFH5在体外结合和传递PA。为了研究配体的特异性，我们在大肠杆菌中重组表达了AtSFH5和AtSFH7的全长和可变片段，只获得了包含AtSFH5预测的Sec14结构域的可溶性片段（AtSFH5-Sec14，残基76到365）（图2A）。首先进行了蛋白质-脂质叠加实验，发现重组的AtSFH5-Sec14能与两种PA和磷脂酰肌醇二磷酸和三磷酸相互作用（图2B）。已经显示酵母和人类的Sec14家族蛋白能够结合和传递磷脂酰肌醇（PI）和磷脂酰胆碱（PC）分子（19, 20）；然而，叠加实验没有显示AtSFH5-Sec14与这些磷脂有相互作用（图2B）。已经通过使用荧光标记的7-硝基苯并-2-氧杂-1,3-二氮烯（NBD）标记的PC，显示了Saccharomyces cerevisiae ScSec14p可以通过结合实验结合PC（21）。然后，我们检查了NBD-PC与植物、人类和酵母Sec14结构域的结合，并发现AtSFH5-Sec14可以结合NBD-PC（附录S4A，图S4A）。在使用NBD-PA（18:1/12:0-NBD）进行的类似实验中，添加AtSFH5-Sec14显著增加了NBD荧光，而添加后的更大变化表明AtSFH5-Sec14对PA（和PC）具有更高的亲和力，优于ScSec14p和ScSfh1p（图2C）。值得注意的是，人类HsSec14L2-Sec14结构域可能既不结合PC也不结合PA。由于叶绿体PA的酰链（sn-1/2）组成主要是棕榈酸（16:0）和不饱和的C18脂肪酸，因此还测试了另一种NBD-PA（16:0/12:0），它也可以弱结合到AtSFH5（附录S4B，图S4B）。因此，AtSFH5可以结合不同种类的叶绿体PA，但酰链组成可能会影响它们的结合亲和力。
为了确定结合亲和力，通过将AtSFH5-Sec14蛋白质的小量加入含有2μM NBD-PA的溶液进行滴定实验（图2D）。出人意料的是，随着AtSFH5-Sec14浓度的增加，结合程度线性增加，然后在约0.5μM蛋白质浓度达到平台。这一特征表明实验在化学计量结合条件下进行（即总脂质浓度至少是表观解离常数的10倍）。值得注意的是，荧光增加斜率与最大值的交点给出了蛋白质-脂质复合物的化学计量，估计在溶液中的NBD-PA的有效量约为0.48μM（大约为25%的可访问性）。因此，AtSFH5-Sec14对PA的结合非常紧密，估计的解离常数低于0.05μM。
由于PA主要位于细胞膜中，我们建立了基于脂质体的PA结合/提取实验（图2E）。嵌入脂质体中的NBD-PA的荧光信号会由于与1,2-二棕榈酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-N-(罗丹明B磺酰)-PE（Rhod-PE）之间的荧光共振能量转移而猝灭，当NBD-PA被Sec14蛋白结合（并提取）时，NBD信号将变得解猝灭。事实上，添加AtSFH5-Sec14导致NBD-PA荧光大幅增加，而人类和酵母同源蛋白的影响很小（图2E）。然而，在基于脂质体的磷脂酰肌醇磷酸（PIP）结合实验中，几乎没有检测到荧光变化，这表明PIP可能不是Sec14家族的生理配体（附录S4C）。
为了评估PA传递能力，我们进行了运输实验，将供体脂质体（PC/PE）与NBD-PA（18:1/12:0或16:0/12:0）和受体脂质体（仅PC/PE）结合（图2F和附录S4D）。添加AtSFH5-Sec14导致NBD-PA信号的解猝灭，证明了AtSFH5能够高效地在膜之间传递PA。值得注意的是，18:1/12:0 NBD-PA的传递速度比16:0/12:0 NBD-PA快，与AtSFH5-Sec14结构域更喜欢不饱和和/或长酰链的PA相符，这正是拟南芥ER中合成的主要PA物种（1）。这些体外结果表明，AtSFH5能够特异性识别嵌入脂质体中的PA，并在膜之间高效地传递PA，而酵母或人类的Sec14蛋白不能执行这一功能。
AtSFH5-Sec14与PA的复合物的整体结构。为了研究PA识别的机制，我们尝试了在与L-α-PA和DPPA复合物中晶化和测定AtSFH5-Sec14的结构，分辨率分别为1.95 Å和2.1 Å（图3A和B以及附录S1表）。这两个结构每个不对称单元包含两个分子（称为Mol A和Mol B），每个分子都结合了一个PA（附录S5 A和B图）。在复合物结构中，AtSFH5-Sec14结构域采用了典型的双叶Sec14折叠。N末端亚结构域（残基76到151）包含了α1-3螺旋的三脚架结构，C末端亚结构域可以分为两部分，一个核心区域（152到326）和一个C末端尾巴（327到365）。核心区域由五股β折叠（β1-5）围绕着α4-10螺旋组成，PA配体埋在一个大口袋中。N末端亚结构域位于配体结合口袋的顶部，而C末端尾巴呈伸展构象，与核心区域和三脚架结构的表面相互包装。Mol B中的最后一个螺旋在这两个结构中都无序，如果没有指示，后续的结构分析将基于1.95 Å的Mol A进行。
核心区域和N末端亚结构域（如果存在），以及它们对应的位置和取向，在植物、酵母和人类Sec14结构中高度保守（图3A和B以及附录S5C图）（22）。有趣的是，C末端尾巴采用了不同的构象。在AtSFH5-Sec14中，C末端尾巴的N末端一半是一个灵活的环，用来屏蔽核心β-折叠；特别是，Pro340和Trp341与β1-2股和螺旋α6上的残基形成疏水相互作用（图3C）。核心螺旋α6还与C末端螺旋α11及其相邻的环相互作用，形成一个疏水槽，容纳来自N末端亚结构域的Leu77和Ile79。此外，最C末端的螺旋α12的带电或极性侧链Arg358、His359和Asn360与N末端三脚架结构中的残基直接或通过水介导形成多个氢键相互作用（图3D）。大量的疏水和亲水相互作用可能稳定了AtSFH5-Sec14的C末端尾巴的伸展构象。然而，即使在高度保守的酵母蛋白中，额外的最N末端螺旋也阻止了C末端尾巴朝向三脚架结构的突出。
为了评估尾部区域的作用，我们对SFH5-Sec14进行了逐步的C末端截断和位点特异性突变；然而，许多突变影响了蛋白质的折叠和溶解度（图3E）。特别是，两种去除了保护中央β-折叠部分的截断（Δ327到365和Δ342到365），以及替代关键相互作用残基（P340A/W341A）的突变都导致了完全不溶解。删除C末端的一个或两个螺旋（Δ353到365和Δ346到365）以及在该区域内的突变降低了AtSFH5-Sec14的溶解度，可能是由于破坏了与N末端亚结构域的相互作用。我们还进行了一些N末端的截断和突变（图3E）。事实上，去除或突变最N末端环也会损害重组蛋白的溶解度，而三脚架结构的突变效果更为严重。可溶性的突变蛋白经过PA结合和传递实验，其活性与它们的溶解度基本一致（图3E）。因此，N末端亚结构域和C末端尾巴都是AtSFH5-Sec14结构域正确折叠所必需的，但不直接参与PA的传递。
AtSFH5-Sec14对PA的识别。在AtSFH5-PA复合物中，遗漏图显示了核心区域的连续电子密度，允许适配16:0/18:1 PA（L-α-PA混合物中的主要物种）和16:0/16:0 DPPA，分别（附录S6A和B图）。两种PA配体都嵌套在由中央β-折叠和几个α-螺旋形成的大腔中。在AtSFH5-L-α-PA复合物中，sn-1链（棕榈酰16:0）与螺旋α4-7的疏水侧链和相邻环的大量接触，而sn-2链（油酰18:1）位于主要由β3-5股和螺旋α8上的残基形成的疏水槽中（图4A）。此外，PA的磷酸酯部分与β-褶皱上的Tyr167、Ser229、Thr231以及螺旋α7 C端的Asp258、Thr265相互作用，甘油骨架也参与了直接和水介导的氢键。在AtSFH5-DPPA复合物的结构中，头基的结合方式在很大程度上保持一致；然而，与L-α-PA复合物中相比，两个酰链的位置发生了变化（附录S6C图）。螺旋α8-9的门区被认为在调节脂质进入中起作用，它在ScSfh1p中显示为封闭构象，在ScSec14p中显示为打开构象（20, 23）。AtSFH5-Sec14采用了特征性的闭合构象，其门区与一个酰链相互作用，以稳定在AtSFH5-PA复合物中的PA构象。考虑到AtSFH5-Sec14结构域可以容纳不同构象的PA，我们假设PA可能以不同的方向进入AtSFH5的脂质结合口袋。
序列比对显示，在AtSFH7的Sec14结构域中，与PA相互作用的残基在其他SFH蛋白质中也高度保守（图4B和附录S7图）。基于功能上的冗余性，人们认为AtSFH7也能够转运PA，而PA可能是拟南芥SFH亚科的共同配体。然而，在ScSec14p和ScSfh1p中，参与PA甘油骨架识别的残基是不同的，这可能解释了嵌入膜中的PA的低活性（图2E和F和附录S4B图）。更引人注目的是，在AtSFH5-Sec14中，用于容纳PA头基的大部分极性或带电残基被HsSec14L2-Sec14结构域中的疏水氨基酸所替代，其中一个酯链结合槽被Trp164和Tyr171的庞大侧链堵塞。因此，HsSec14L2只能结合小分子配体，而不能结合磷脂类物质（图2C和附录S4A图）。因此，植物SFH蛋白质可以特异性地识别和传递PA，即使它们的Sec14结构域在序列和结构上高度保守，而酵母和人类同源物不能。
为了确认PA结合模式，我们对AtSFH5-Sec14进行了一系列点突变，再次替代一些关键残基显著降低了蛋白质的可溶性（图4C）。双突变体L233W/I251W，旨在位阻酯链结合的构建，完全不溶解，而部分可溶的单个替代体都显示出明显降低的PA结合和传递能力。然而，将Tyr167和Ser229中的任何一个突变为庞大的残基（Y167W和S229W），旨在破坏与PA磷酸部分的极性接触，导致与野生型AtSFH5-Sec14相比，蛋白质的可溶性和PA结合/传递活性显著降低。据报道，ScSec14p的双突变体S173A/T175A由于PC头基结合口袋受损而显著降低了PC传递活性（20）。然而，与野生型蛋白质相比，相应的AtSFH5突变体S229A/T231A对PA的结合和传递几乎相同，证实了AtSFH5的PA结合方式不同于ScSec14p的PC结合方式。不能受影响的突变的一个可能解释是，PA头基仍然可以通过与螺旋α7的极性或带电残基相互作用而稳定地结合（图4A）。综合来看，我们的生化和结构分析表明，Sec14结构域的核心区域在AtSFH5作为PA传递蛋白质的功能中发挥关键作用。
AtSFH5和AtSFH7定位在内质网和叶绿体。融合蛋白AtSFH5-黄色荧光蛋白（AtSFH5-YFP）[AtSFH5-红色荧光蛋白（AtSFH5-RFP）]或AtSFH7- YFP（AtSFH7-RFP）在烟草（尼科蒂阿娜·本特哈米亚）叶片中进行瞬时表达，或者与ER-rk CD3-959（一种ER标记物）融合的mCherry或G-gk CD3-963（一种高尔基标记物）融合的绿色荧光蛋白（GFP）（24）一起在拟南芥原生质体中稳定表达，以确定它们的亚细胞定位。观察显示，AtSFH5和AtSFH7主要定位在膜结构中（SI附录，图S8A）。详细分析进一步显示，ER-rk CD3-959-mCherry与AtSFH5-YFP完全共定位，与AtSFH7-YFP部分共定位（图5A），证明AtSFH5和AtSFH7定位在内质网。然而，AtSFH5-RFP或AtSFH7-RFP未显示与G-gk CD3-963-GFP的共定位（SI附录，图S8B），表明它们不定位于高尔基器，并且它们传递的PA不依赖于从高尔基的囊泡分泌途径。进一步观察显示，AtSFH5-YFP和AtSFH7-YFP还定位在叶绿体中（图5B），表明AtSFH5和AtSFH7在内质网和叶绿体中都有双重定位。
大多数拟南芥SFH蛋白在Sec14结构域的C-末端包含一个植物特有的nodulin结构域，通过一个长的灵活区域（约100个氨基酸残基）连接在一起。考虑到nodulin结构域对SFH蛋白的亚细胞定位至关重要（25），我们的分析确实显示，删除AtSFH5和AtSFH7的nodulin结构域导致了膜结构中明显改变的亚细胞定位。然而，删除Sec14结构域并没有明显改变AtSFH5和AtSFH7的亚细胞定位（SI附录，图S9），表明Sec14结构域不参与SFH蛋白的亚细胞定位决定。
脂质代谢在sfh5 sfh7叶绿体中发生了显著的改变。为了进一步研究AtSFH5和AtSFH7通过运输PA从而影响叶绿体发育的效应，我们创新地应用了叶绿体亚细胞脂质组学方法来分析叶绿体的脂质成分。叶绿体从23天大的植物中分离出来并验证其完整性，然后提取并使用ESI-MS/MS进行定量分析。结果显示，磷脂减少了，特别是PA在sfh5 sfh7叶绿体中显著减少（图5C）。详细分析显示，具有长链不饱和脂肪酰基的PA种类（总碳:双键; 34:2, 34:3, 36:1, 36:2, 36:4, 36:5, 36:6）在sfh5 sfh7中显著减少（SI附录，图S10A），这与AtSFH5更喜欢运输长链不饱和脂肪酰基的PA的结果相一致（图2F和SI附录，图S4D）。叶绿体的磷脂PC和PG也在sfh5 sfh7中减少（SI附录，图S10B）。结合AtSFH5-Sec14具有PC传输活性的结果（SI附录，图S4A），这表明AtSFH5和AtSFH7可能也将PC运输到叶绿体外膜。PA需要在叶绿体的类囊体膜中合成PG（26），前体PA的供应减少可能会影响叶绿体来源的PG的合成。
脂质分析还显示，sfh5 sfh7叶绿体中的半乳甘油脂类MGDG数量显著减少（图5D）。PA磷酸酶专门与叶绿体的内膜结合，将PA去磷酸化为DAG，然后通过MGDG合成酶（MGD）进一步合成为MGDG（27）。降低的MGDG水平表明AtSFH5和AtSFH7参与调控叶绿体脂质的稳态通过运输PA到叶绿体，并且对连续的MGDG合成非常重要。
在植物细胞中，叶绿体的原核途径产生了具有sn-2位C16脂肪酰基的甘油脂类，而真核途径生成了只有C18脂肪酸的甘油脂类分子的甘油脂类（28）。为了进一步确认AtSFH5和AtSFH7通过PA从内质网运输到叶绿体的生物体内，我们分析了sfh5 sfh7中MGDG中sn-2位置的C18脂肪酰基。利用有机质质谱的电子碰撞激发离子化（EIEIO-MS）方法，我们首先通过甘油脂类的sn-1位脂肪酰基的酯类诊断峰确定MGDG中sn-1位的脂肪酸链（通过C1=O，C1–O和C1–C2的键的裂解位点的酯类诊断峰）（SI附录，表S2），然后从MGDG的母离子和sn-1片段（基于峰强度量化）推断出MGDG中sn-2位的脂肪酸。基于每个MGDG中C18和C16脂肪酰链的水平（SI附录，图S12），对总C16和C18组成的分析显示，sn-2位的总C18脂肪酸显著减少（P <0.001），而18:2和18:3的水平较低（P <0.00001）在sfh5 sfh7中明显低于单突变体sfh5，sfh7或Col中的水平。在sfh5 sfh7中，sn-2位C18脂肪酸的降低程度比sn-2位C16脂肪酸的降低程度更显著（图5E），表明sfh5 sfh7中的ER到质体（叶绿体）脂质转移受到了破坏。此外，总脂肪酸组成的分布与先前的研究一致（4–7），表明EIEIO-MS是一种对于植物MGDG的同分异构体识别非常有用的方法。
MGDG进一步合成为DGDG，参与叶绿体的发育和环境响应，MGDG:DGDG比率对于叶绿体的形状至关重要（29）。分析显示，在sfh5 sfh7叶绿体中，DGDG水平保持不变（图5D），这导致了降低的MGDG:DGDG比率，可能会影响叶绿体的发育。基于PA和/或PG对MGD1-MGD3的激活以及PA和/或PG的体外供应促进MGD1表达的必要性（30），转录水平的分析显示MGD1-MGD3基因的表达保持不变，而DGD1的表达明显增加，DGD1是通过将MGDG和尿苷二磷酸半乳糖（UDP）-半乳糖转化为DGDG来进行的主要叶绿体DGDG合成酶（31）（图5F）。考虑到DGD1是核编码基因，这表明在AtSFH5和AtSFH7缺失的情况下，叶绿体中降低的MGDG水平可能会返向促进DGD1的表达，从而导致DGDG水平不变。
通过确定AtSFH5-Sec14与PA配体的复合物结构，我们的研究阐明了SFH蛋白的结合和传递特性的结构基础，并揭示了不同Sec14蛋白之间PA配体特异性的分子机制。AtSFH5和AtSFH7将PA从内质网运输到叶绿体，以维持叶绿体和类囊体膜组分的正确组装（图5G）。从内质网到叶绿体的PA减少导致脂质稳态发生改变（PA和MGDG水平显著降低），从而导致叶绿体和类囊体的发育和功能缺陷，证明了内质网-叶绿体PA转运和脂质运输在叶绿体的构建中的重要性。
作为甘油脂生物合成的中心代谢产物，PA的运输需要合成甘油脂或半乳甘油脂。人类的Sec14含蛋白可以运输多种疏水配体，而酵母ScSec14p在体内识别磷脂PC和PI（14, 32）。在模式植物拟南芥中，AtSFH1具有固有的PI/PC结合活性，而叶绿体定位的Sec14样蛋白（CPSFL1，也称为AtPITP7）更倾向于结合PI一磷酸盐和PA（2）。Sec14结构域高度保守，Sec14蛋白如何精确识别不同的磷脂和其他疏水配体仍然未知，广泛的结构研究将有助于理解配体特异性的分子机制。我们的研究表明，AtSFH5强烈而特异地结合并在膜之间传递PA。来自拟南芥、酵母和人类的Sec14结构域具有高度保守的配体结合口袋，可以容纳各种配体。PA头基位于AtSFH5-Sce14的结合腔内，类似于酵母ScSfh1p的PC/PE结合方式，但与inositol头基位于核心区域和N-末端三脚架结构之间的PI结合方式非常不同。不参与PA头基识别的极性或带电残基的非保守性（图4B和SI附录，图S7）提供了解释为什么酵母和人类成员无法有效识别和传递嵌入膜中的PA的可能原因。然而，ScSfh1p中涉及到PC、PE和PI识别的残基在AtSFH5中也是保守的，这表明AtSFH5可能结合这些磷脂，这与AtSFH5-Sec14可以结合NBD-PC（SI附录，图S4A）一致。此外，不能排除植物SFH蛋白通过其他配体的结合/转运。这些结果有助于理解脂质结合蛋白的识别机制以及细胞之间脂质传输的机制，并提供了有关研究它们在调控脂质代谢和植物发育中作用的有用线索。
人类和植物Sec14成员中有许多是模块化蛋白质，除了保守的Sec14结构域外，还包含各种功能结构域。在已报告的结构中，人类的HsSec14L2/3/4和神经纤维瘤蛋白（NF1）分别包含一个GOLD结构域或一个PH结构域（33）。这些附加结构域结合在Sec14结构域底部，与三脚架结构相对应（SI附录，图S5C）。因此，人类Sec14结构域的C端尾部相对较短，取向与AtSFH5-Sec14中的尾部不同，这首次揭示了为什么植物SFH的Sec14结构域能够特异性地结合PA的性质。此外，拟南芥SFH蛋白的植物特异性根瘤蛋白结构域对于其正确的亚细胞定位是必要的，探索植物特异性根瘤蛋白结构域的结构以及植物特异性根瘤蛋白结构域如何调节Sec14结构域的功能是有趣的课题。
在种子植物中，叶绿体膜脂质的生物合成涉及两个细胞器和三个膜双层：内质网、叶绿体内和外包膜。膜接触位点（MCSs）和与细胞器之间的相互作用的系留蛋白在哺乳动物和酵母中已经得到广泛研究（34）。最近的研究揭示了植物细胞中ER-叶绿体MCSs的动态结构（35），这使得PA从ER传递到叶绿体的密切接触成为可能（通常距离为10到40纳米）。先前鉴定的TGD复合物参与了从ER到质体的PA传递（4-7），NDGD1结合PA并介导体外膜融合（18）; 我们的研究结果确定了一种PA传递机制，即PA由AtSFH5和SFH7从ER传递到叶绿体，以建立叶绿体的特殊类囊体膜，为调控细胞器间磷脂转运的调控和效应提供了线索。PA是否从ER传递到叶绿体是在ER-叶绿体MCSs上发生的仍需进一步研究。
系统性分析细胞器脂质组成有助于阐明各种细胞器的发育和功能。在动物中，细胞器脂质组学分析揭示了在小鼠肝细胞的细胞器（核和线粒体）之间协调昼夜节律的脂质组成（36）。以前曾通过薄层色谱法分析叶绿体半乳糖脂的组成，通过手性色谱法分离混合DAGs，并通过气相色谱质谱法（GC-MS）分析酰基（4）。在这项研究中，开发了叶绿体脂质组学分析方法，允许对叶绿体脂质种类和类别进行全面分析。AtSFH5和AtSFH7的缺陷导致叶绿体中长链不饱和脂肪酸链的PA物种减少（SI附录，图S10A），这是拟南芥ER中主要合成的PA物种（1），与AtSFH5-Sec14能够更快地传递18:1/12:0 NBD-PA相一致，与16:0/12:0 NBD-PA相比。叶绿体脂质组学分析不仅确认了半乳糖脂MGDG和磷脂PG是叶绿体中的主要脂质，还量化了不同种类的脂质，为研究脂质在叶绿体发育中的作用提供了有用的线索。 最近，基于质谱的方法在脂质的分子表征方面取得了重大进展。EIEIO-MS的良好文献方法被应用于区分脂质组中的同分异构体，以及每种脂质类别中不同酰基链的唯一定义分布，例如磷脂/半乳糖脂中的sn-1和sn-2，以及三酰甘油从天然脂质提取物（橄榄油）中的sn-2和（sn-1/3），它们代表了已识别的酰基组的头基和同分异构体分配，以及基于产生自由电子的能量产生的自由电子约10电子伏的自由电子的自由电子在酰基链内的碳-碳双键位置（37-39）。通过将EIEIO-MS应用于分析sfh5 sfh7中MGDG的sn-2位置的C18脂肪酰基，我们证明了sfh5 sfh7中sn-2位置的总C18脂肪酸明显减少，提供了证据表明AtSFH5和AtSFH7具有在体内从ER传递PA的能力。
异常合成半乳糖脂MGDG会影响光合作用、叶绿体超微结构和光合活性（3, 31）。MGDG的减少导致了双层与非双层形成的膜脂质比例的变化，MGDG:DGDG比值的增加导致了叶绿体形状的改变（29）。在sfh5 sfh7中，显著减少的MGDG和正常的DGDG量导致了MGDG:DGDG比值的减小和叶绿体形状的改变（更小且扁平），表明MGDG/DGDG的平衡对正常叶绿体发育至关重要。尽管MGDG水平显著降低，但上调的DGD1基因可能导致sfh5 sfh7中DGDG的正常水平，这表明改变的MGMG水平/脂质代谢可能通过逆行信号传导调节核编码的DGD1基因的表达。
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总结
这篇文章详细探讨了AtSFH5和AtSFH7两个蛋白在调控植物叶绿体发育中的重要作用。研究人员发现这两个蛋白通过介导磷脂酸（PA）的运输，参与了叶绿体膜脂质的合成和维持。文章通过一系列实验和结构生物学的方法，揭示了这一过程的分子机制，为我们更深入地理解细胞内脂质代谢和叶绿体发育提供了重要线索。
首先，文章阐述了AtSFH5和AtSFH7的功能。这两个蛋白主要定位在内质网（ER）和叶绿体，通过一个称为Sec14域的结构域来识别和转运PA。研究人员利用一系列生物化学实验和结构分析方法揭示了这两个蛋白如何特异性地识别和转运PA。值得注意的是，这种特异性识别和转运PA的机制在酵母和人类蛋白中并不普遍存在，这强调了植物SFH蛋白在这一生物过程中的重要性。
文章还描述了AtSFH5和AtSFH7在叶绿体和ER之间的定位。通过荧光标记实验，研究人员发现这两个蛋白在ER和叶绿体中均有定位，进一步确认了它们在维持这两个细胞器之间的PA运输中的关键作用。
进一步的脂质组学分析揭示了AtSFH5和AtSFH7的功能影响。在sfh5 sfh7突变体中，叶绿体中PA的含量显著减少，特别是富含长链不饱和脂肪酸的PA种类。这些结果进一步证明了这两个蛋白在调控叶绿体膜脂质的合成中的重要性。此外，这两个突变体的叶绿体中还出现了MGDG（一种半乳糖脂）含量的显著下降，这对叶绿体的形态和功能产生了影响。文章强调了MGDG和DGDG（另一种脂质）比例的重要性，以维持叶绿体的正常发育。
最后，文章提出了一些未来的研究方向。例如，如何在ER和叶绿体之间发生PA的运输，以及这一过程是否发生在这两个细胞器之间的膜接触位点上，都是需要进一步研究的问题。此外，文章还提到了植物SFH蛋白中存在的一些额外结构域，这些结构域可能对其功能产生影响，未来可以对这些结构域的结构和功能进行更深入的研究。
总的来说，这篇文章揭示了AtSFH5和AtSFH7在植物叶绿体发育中的关键作用，为我们更好地理解植物细胞内脂质代谢和叶绿体发育提供了有价值的信息。这些发现有望为农业和生物燃料生产等领域的植物改良提供新的思路和方法。
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