显微镜分辨率：概念、因素和计算

　　在显微镜学中，‘分辨率’一词用于阐述显微镜对细节进行区分的能力。换言之，这是样本内两个能被观察人员或者显微镜摄像头区分的实体点之间的理想的距离。

　　显微镜的分辨率本质上与光学元件的数值孔径（NA）以及用于观察样本标本的光波长有关。此外，我们必须考虑Ernst Abbe于1873年首次提出的衍射极限。

　　本文章包含了这些概念的历史介绍并使用相对简单的术语对其进行了解释。

分辨率与数值孔径

　　数值孔径（NA）与光通过的介质的折射率（n）以及给定物镜的孔径角（α）有关（NA=n × sin α）。显微镜的分辨率不仅取决于物镜的NA，还取决于整个系统的NA，要把显微镜聚光镜的NA也纳入考虑。在显微镜系统中，所有光学元件都正确对齐、具有相对较高的NA值并且相互协调工作，可以分辨出更多的图像细节。分辨率还与标本成像所用的光波长有关；波长越短，可分辨的细节越多，波长越长则分辨细节越少。

　　在处理分辨率时需要考虑三个数学概念：‘阿贝衍射极限’、‘艾里斑’和‘瑞利判据’。以下按时间顺序逐一介绍。

George Biddell Airy与‘艾里斑’（1835）

　　George Biddell Airy（1801-1892）是英国数学家和天文学家。1826年，25岁的他被任命为三一学院的数学教授，两年后，被任命为新剑桥天文台的天文学教授。1835年到1881年期间，他是“皇家天文学家”，月球和火星上各有一处以他的名字命名的陨石坑。

　　1835年，他在剑桥哲学学会学报上发表了一篇题为《有关圆孔径物镜的衍射》的论文。Airy在论文中以一个天文学家的视角描述了通过一个精良的望远镜观察到的恒星周围的光环或者射线的形状及亮度。尽管是从不同的科学领域发表的文章，但这些观察结果与其他光学系统，特别是显微镜存在着关联。

　　艾里斑(Airy Disc)是在衍射限制的系统中由圆形孔径形成的聚焦的光点。如图1所示，其呈现为中央亮点和周围是明暗相间的同心环（更准确地说，这是艾里图案Airy pattern）。

　　衍射图案由光的波长和光所通过的孔径大小决定。艾里斑的中心点含有大约84%的光强，其余16%分布于环绕该点的衍射图案中。当然，用显微镜进行观察时标本上会有许多光点，因此基于大量的艾里图案来考虑，而非如“艾里斑”描述的单个光点来考虑是更妥当的方式。

图1右所示的艾里图案三维表示又称为‘点扩散函数’。

图1：艾里图案，或称艾里斑的典型现象，由其中心的理想的光点和环绕的衍射环组成。

Ernst Abbe与‘Abbe衍射极限’（1873）

　　Ernst Karl Abbe（1840-1905）是一位德国数学家和物理学家。他与Carl Zeiss共同创立了“蔡司光学工作室”即现在的蔡司公司。除此之外，他还在1884年联合创办了Schott Glassworks。Abbe还是定义数值孔径这一术语的首位学者。1873年，Abbe发表了自己的理论和公式对显微镜的衍射极限进行了解释。Abbe发现，标本图像由许多重叠的、多强度且存在衍射极限的点（或艾里斑）所组成。

　　要提高分辨率（d=λ/2 NA），标本必须使用波长（λ）更短的光来进行观察，或者通过折射率相对高的成像介质来进行观察，又或者使用NA较高的光学组件来进行观察（或者将全部3种因素组合起来）。

　　但即便将所有这些因素都考虑在内，显微镜系统的极限依然受到限制，因为系统复杂性，波长低于400 nm的光在玻璃中的传播特征，以及整套显微镜需要达到较高的NA。理想光学显微镜的横向分辨率限制在200 nm左右，而轴向分辨率约为500 nm（有关分辨率极限示例，请参见下文）。

John William Strutt与‘瑞利判据’（1896）

　　第三代瑞利男爵John William Strutt（1842-1919）是一名英国物理学家，也是一位高产学者。他一生编写了多达466篇论文，包括430 篇科研论文。他的论文涉猎极广，各种主题都有，如鸟类飞行、心理研究、声学等等。1895年，他发现了氩并凭借这一发现于1904年获得诺贝尔奖。

　　Rayleigh以George Airy的理论为基础上并进一步延伸，于1896年创造了“瑞利判据”理论(Rayleigh Criterion)。瑞利判据（图2）在衍射极限系统当中定义了分辨率极限，换言之，就是何时能够将2个光点相互区分或分辨。

　　使用艾里斑理论，如果2个单独艾里斑的衍射图案不重叠，则就可以轻松区分、‘分辨’两者并认定满足瑞利判据（图2，左图）。而当艾里斑的中心直接重叠于另一个艾里斑的第一理想的衍射图案时，则两者认定为‘刚好分辨’，同时依然可以区分为2个独立的光点（图2，中图）。如果艾里斑再继续相互接近，则两者无法满足瑞利判据，因此“无法被分辨”为2个不同的光点（或者标本图像中的单独细节；图2，右图）。

图2：分辨率极限（按瑞利判据来定义），两个单独艾里斑的重叠衍射图案：左图：分辨良好；中图：刚好分辨；右图：未分辨

如何计算显微镜的分辨率

　　将以上全部理论都考虑在内就可以明显看出，在计算分辨率的理论极限时需要考虑很多因素。分辨率还取决于样本性质。我们来看一下使用阿贝衍射极限以及使用瑞利判据进行的分辨率计算。

　　首先应当要牢记：NA= n x sin α

　　式中n为成像介质的折射率，α是物镜孔径角的一半。物镜的理想的孔径角大约为144。该角度一半的正弦为0.95。如果使用油浸物镜且折射率为1.52，则物镜的理想的NA为1.45。如果使用‘干式’（无浸没）物镜，则物镜理想的NA为0.95（因为空气的折射率为1.0）。

　　横向（即XY）分辨率的阿贝衍射公式为：d= λ/2 NA

　　式中λ 是标本成像所用的光波长。如果使用514 nm的绿光及NA为1.45的油浸物镜，则分辨率的（理论）极限将达到177 nm。

　　轴向（即Z）分辨率的阿贝衍射公式为：d= 2 λ/NA2

　　同样的，如果我们假设通过波长514 nm的光来观察标本且物镜NA数值为1.45，则轴向分辨率为488 nm。

　　在阿贝衍射极限的基础上，瑞利判据稍稍得到了细化：R= 1.22 λ/NAobj+NAcond

　　式中λ为标本成像用的光波长。NAobj 为物镜NA。NAcond为聚光镜NA。‘1.22’是一个常系数。该数值根据Rayleigh的贝塞尔函数研究推导得出。这些主要用于对系统当中的问题，例如波的传递，进行计算。

　　将聚光镜的NA考虑在内，空气（折射率为1.0）通常是聚光镜和玻片之前的成像介质。假设聚光镜的孔径角为144，则NAcond数值将等于0.95。

　　如果使用514 nm的绿光，油浸物镜的NA为1.45，聚光镜的NA为0.95，则分辨率的（理论）极限将达到261 nm。

　　如上所述，用于对标本成像的光波长越短，可以分辨的细节越多。因此如果使用400 nm的理想的可见光波长，油浸物镜NA为1.45，聚光镜NA为0.95，则R等于203 nm。

　　要在显微镜系统当中达到（理论）分辨率的理想值，每个光学组件都应当具备理想的可用的NA（把孔径角纳入考虑）。此外，观察标本所用的光波长越短则分辨率越高。最后，整个显微镜系统都应当准直对齐。